* Nguồn: Falah M. và cộng sự (2017) [77]
Trình tự hồn chỉnh vùng D-loop của nhiều dân tộc thuộc các châu lục trên thế giới đã được công bố trong ngân hàng dữ liệu gen quốc tế về DNA ty thể (http://www.mitomap.org). Đã có nhiều trình tự vùng D-loop đã được cơng bố, trong đó có 101 trình tự hồn chỉnh của hệ gen ty thể người thuộc các chủng tộc người khác nhau được nghiên cứu và đăng ký [78]. Tuy nhiên, với tần số đột biến cao, nhiều điểm đa hình nên hai vùng siêu biến HV1 và HV2 được tập trung nghiên cứu hơn cả, đặc biệt là vùng siêu biến 1.
Ở một số cá thể, vùng siêu biến HV1 và HV2 có các đoạn lặp lại liên tiếp các nucleotide Cytosine, thường được gọi là các đoạn poly C. Ở vùng HV1 (dài
359 bp), đoạn poly C nằm từ vị trí 16183 - 16193 cịn ở vùng HV2 (dài 315 bp) đoạn poly C nằm từ vị trí 303 - 327. Ở trình tự tham chiếu CRS (trình tự hệ gen ty thể hồn chỉnh của người đầu tiên được Anderson và cộng sự công bố vào năm 1981), đoạn poly C của vùng HV1 được ngắt quãng bởi nucleotide Thymine ở vị trí 16189, tuy nhiên rất nhiều trình tự DNA ty thể có đột biến T16189C tạo thành chuỗi có 10 nucleotide Cytosine liên tiếp. Đột biến T16189C được xem là có tốc
độ đột biến cao nhất trong hệ gen ty thể người [79]. Nghiên cứu cho thấy có hiện tượng “dị tế bào chất” ở đoạn poly C này, tức là trong tế bào và cơ thể có nhiều loại DNA ty thể có chiều dài và trình tự đoạn poly C khác nhau. Điều này có thể là do sự dịch khung đọc trong q trình sao chép DNA. Tỷ lệ phần trăm các phân tử DNA ty thể mang các độ dài đoạn poly C khác nhau là ổn định ở mỗi cá thể, được duy trì theo dịng mẹ và được tạo mới trong quá trình phát triển [80].
- Vùng D-loop của DNA ty thể trong nghiên cứu quan hệ di truyền người
Hầu hết các nghiên cứu về tiến hóa của người đều dựa trên việc giải trình tự DNA ty thể, đặc biệt là trình tự vùng điều khiển D-loop. Việc phân tích các đa hình di truyền trong các trình tự nucleotide của DNA ty thể đã làm sáng tỏ về tiến hóa của lồi người ở khía cạnh nguồn gốc của các quần thể người hiện đại và các mơ hình di cư của lồi người. Phân tích đa hình trình tự DNA ty thể để phân loại cá thể theo các nhóm đơn bội và dị tìm tổ tiên tập trung chủ yếu vào nghiên cứu trình tự vùng siêu biến 1 và 2, đặc biệt là vùng siêu biến 1. Điều này có được do tính đa hình rất lớn của đoạn HV1. Trong 419 trình tự nucleotide của đoạn HV1 có 275 ví trí nucleotide thay đổi, 188 vị trí mang 2 nucleotide khác nhau (164 vị trí là đồng hốn, 24 vị trí là dị hốn), 66 vị trí với 3 nucleotide và 21 vị trí có mặt cả 4
nucleotide [81].
Do tần số đột biến cao như vậy nên vùng điều khiển D-loop nói chung và hai đoạn siêu biến HV1 và HV2 nói riêng cũng thu hút sự tập trung nghiên cứu về mối liên hệ của nó với bệnh tật, đặc biệt là các bệnh ung thư, bệnh di truyền, bệnh về cơ, thần kinh... Đa số các nghiên cứu cho thấy có mối liên hệ nhất định giữa các bệnh với trạng thái dị tế bào chất ở DNA ty thể của các bệnh nhân [82],[83]. Mặc dù các nghiên cứu về vùng siêu biến 2 được thực hiện trong những năm gần đây tuy nhiên người ta vẫn chưa tìm thấy mối liên quan giữa vùng siêu biến 1 và vùng siêu biến 2 của DNA ty thể. Các nghiên cứu khác nhau đã đánh giá tốc độ đột biến liên quan tới phả hệ của vùng HV1 và HV2 tuy nhiên vấn đề này vẫn còn gây tranh cãi.
Hai vùng siêu biến 1 và 2 dường như có q trình tiến hóa như nhau mặc dù tính đa hình ở hai vùng chưa được nghiên cứu, so sánh ở mức độ sâu. Do DNA ty
thể không tái tổ hợp nên tồn bộ phân tử có một lịch sử tiến hóa chung. Tuy nhiên, hai vùng HV1 và HV2 lại có tốc độ đột biến khác nhau và nếu sự khác nhau trong tốc độ đột biến này đủ lớn thì các yếu tố đa hình của hai vùng siêu biến có thể phản ánh được các q trình tiến hóa khác nhau [84].
Tốc độ đột biến của DNA ty thể cao nhất ở vùng điều khiển D-loop tuy nhiên tốc độ đột biến này lại phụ thuộc vào các vị trí nucleotide khác nhau [62], [85]. Một vài vị trí nucleotide trong vùng điều khiển đột biến thường xuyên hơn các vị trí khác và thường được gọi là các điểm nóng đột biến (mutational “hotspots”) [86]. Có rất nhiều loại đột biến trong vùng điều khiển nhưng chủ yếu là các đột biến thay thế. Các đột biến này có vai trị rất quan trọng trong việc nghiên cứu nguồn gốc của người hiện đại. Sau khi trình tự hồn chỉnh của DNA ty thể được công bố và sau bài báo của Cann và cộng sự (1987) thì DNA ty thể thực sự trở thành một chỉ thị di truyền trong việc tái dựng lại q trình tiến hóa của lồi người [87]. Thêm vào đó, tổng hợp các số liệu về vùng mã hóa và vùng điều khiển của DNA ty thể cho phép xếp các đa hình DNA ty thể vào các nhóm đơn bội khác nhau. Việc nghiên cứu hệ gen ty thể, giải mã trình tự nucleotide của các vùng siêu biến HV1 và HV2 của vùng điều khiển D-loop cũng như các gen khác của ty thể, dẫn đến giải mã toàn bộ hệ gen ty thể của nhiều đại diện các dân tộc khác nhau sẽ cung cấp số liệu để phân loại các nhóm đơn bội chính xác và chi tiết hơn.
Ngồi mục đích nghiên cứu các quan hệ di truyền theo mẫu hệ, nghiên cứu về hệ gen ty thể các tộc người trên thế giới, đặc biệt là hai vùng siêu biến HV1 và HV2 còn được dùng để xác định cá thể và quan hệ huyết thống, trong giám định hài cốt liệt sỹ, giám định pháp y, điều tra tội phạm… Hiện nay, cùng với các nghiên cứu về DNA ty thể, một đối tượng khác cũng được chú ý trong nghiên cứu di truyền quần thể là nhiễm sắc thể Y [88]. Nếu như DNA ty thể di truyền theo dịng mẹ thì sự phân tích nhiễm sắc thể Y, đặc biệt là vùng khơng tương đồng với nhiễm sắc thể X, giúp ta có cái nhìn về q trình di truyền theo dòng bố. Với sự kết hợp hai nguồn số liệu về DNA ty thể và nhiễm sắc thể Y thì bức tranh về lịch sử tiến hóa của lồi người, mối quan hệ giữa các dân tộc trên thế giới đã trở nên rõ
ràng và chính xác hơn. Mặc dù vậy, DNA ty thể với những thế mạnh của nó, vẫn chứng tỏ là một công cụ hữu hiệu trong các nghiên cứu về quan hệ di truyền người.
- Gen mã hóa NADH Dehydrogenase tiểu phần 5
Gen ND5 là gen chức năng, gồm 1812bp, từ vị trí nucleotide 12337 tới
nucleotide 14148, được mã hoá bởi chuỗi nặng giàu Guanine của DNA ty thể. Đây
là gen có trình tự mã hố liên tục có trọng lượng phân tử khoảng 66,6 kD.
Chuỗi mRNA của gen ND5 bắt đầu bằng mã mở đầu là AUA-Methionine và kết thúc là mã UAA. Ngồi ra, mRNA cịn có một trình tự khơng mã hố ở đầu 3’, dài 521 bp, nằm ở phía trước đi polyadenin. Trình tự này đối nghĩa với trình tự của gen ND6 nằm ở chuỗi nhẹ. Chuỗi mRNA của gen ND5 được phiên mã như là một phần của sự phiên mã chuỗi nặng polycistronic.
Những đột biến gen ND5 ty thể cũng đã được nghiên cứu và chỉ ra rằng có liên quan tới nhiều bệnh như Liệt thần kinh thị giác di truyền Leber (LHON), Hội chứng Leigh hoặc Hội chứng MELAS…
Bệnh Liệt thần kinh thị giác di truyền Leber gây ra do sự thay đổi allele, chuyển Alanine 458 thành Threonine (A458T). Một đột biến nữa cũng gây ra bệnh này là đột biến chuyển vị trí nucleotide 13730, dẫn đến sự thay thế Glycine bằng
Glutamic acid ở vị trí 465 của chuỗi polypeptide ND5 (G465E). Các nghiên cứu
chỉ ra rằng đột biến này có thể bắt nguồn từ trong dịng phơi của mẹ.
Hội chứng Leigh có liên quan tới sự biến đổi T -> C ở vị trí nucleotide 12706 của gen ND5, làm biến đổi trình tự amino acid Phenylalanin thành Leucin ở vị trí 124 (F124L).
Đặc điểm của Hội chứng MELAS là rối loạn thần kinh trung ương, tăng CSF lactat…có liên quan tới sự biến đổi A -> G ở vị trí nucleptid 12770 của gen ND5, dẫn đến đột biến thay Glutamic acid thành Glycine (E145G).
- Gen mã hóa NADH dehydrogenase tiểu phần 6
Gen ND6 là một trong 13 gen mã hoá protein của ty thể, nằm trên chuỗi nhẹ của DNA ty thể ở vị trí từ nucleotide thứ 14149 đến 14673 [8]. Gen gồm 524bp với trình tự mã hố liên tục, khơng có các đoạn intron. Trên phân tử mRNA bộ ba mã mở đầu là AUG mã hoá cho Methionine và bộ ba kết thúc là UCG. Phân tử mRNA
có đoạn trình tự khơng mã hố ở đầu 3’ bao gồm 1811 nucleotide tương ứng với trình tự đối mã của gen ND5. Đoạn trình tự này có thể cịn kéo dài qua gen mã hố tRNALeu(CUN), tRNASer(AGY), tRNAHis, gen ND4 và kết thúc gen mã hoá tRNAArg.
- Gen mã hóa Cytochrome B
Gen CYTB là một gen nằm trên chuỗi nặng của genome ty thể mã hoá cho một tiểu đơn vị của phức hệ hô hấp III. Gen này có chiều dài 1141bp, từ vị trí
nucleotide 14747 đến vị trí nucleotide 15887, khơng có đoạn intron [8]. Chuỗi polypeptide dài 380 amino acid do gen CYTB có vai trị quan trọng trong chuỗi hơ
hấp tế bào thơng qua việc xúc tác q trình vận chuyển điện tử từ ubiquinol (Coenzyme khử Q10) đến cytochrome c và sử dụng năng lượng để vận chuyển các proton từ màng trong ty thể ra màng ngoài ty thể. mRNA được phiên mã từ CYTB có một vùng có 4 nucleotide, nằm ở đầu 5’ khơng mã hố nằm sau bộ ba (codon) khởi đầu AUG, và kết thúc cùng với nucleotide U của bộ ba kết thúc UAA [8], [89], [90]. Nó được mơ tả như là một phần của bản sao mã của chuỗi gen nặng H, được gắn thêm bởi hai bản sao mã của hai protein tRNA-Glu và tRNA-Thr. Những tRNA này được cắt ra để tạo nên bản sao mã khử 11 hay CYTB mRNA. mRNA sau đó được polyadenyl hố hồn tồn bởi bộ ba kết thúc [8], [89], [91].
Khối lượng phân tử của CYTB theo ước tính là 42729 Da [8]. Tuy nhiên, tính kỵ nước của nó tạo ra một khả năng di chuyển khác nhau trên SDS -PAGE với trọng lượng phân tử biểu hiện ra bên ngoài bị thay đổi. Sử dụng đệm Tris - glycine thấy nó di chuyển trọng lượng xấp xỉ 27,5 kDa [92]; [93], Sự khác biệt giữa kích thước mong đợi và kích thước ước tính được giải thích bởi sự sai lệch đã biết về ước tính kích thước trên SDS- PAGE của các protein kỵ nước được mã hóa mtDNA[94].
Tính đa hình của gen CYTB
Andreu A.L. và cộng sự (1999) đã cơng bố các điểm đa hình trên gen CYTB của người dựa trên phân tích trình tự 32 cá thể người Cáp - ca, thuộc chủng tộc người da trắng. Tác giả đã ra 27 điểm đa hình, trong đó, có 15 điểm làm thay đổi amino acid. Dựa trên phương pháp phân tích đa hình đoạn hạn chế (Restriction
mẫu hệ, các tác giả kết luận rằng, những thay thế amino acid đại diện cho sự đa hình di truyền theo dịng mẹ. Phân tích so sánh số liệu cho thấy 4 kiểu gen khác nhau có thể sử dụng để xác định gen CYTB của người [95].
Sau đó, Andreu A.L. đã tiến hành một nghiên cứu khác trên nhóm 5 bệnh nhân mới với tình trạng khơng dung nạp vận động. Trong nghiên cứu này, họ đã xác định được các đột biến ở gen CYTB và xem xét lại đặc điểm của 4 bệnh nhân đã được xác định trước đó. Họ kết luận rằng có một dạng bệnh cơ do ty thể xuất hiện lẻ tẻ, trong đó triệu chứng khơng dung nạp vận động là một triệu chứng nổi bật. Mỗi một đột biến trong gen CYTB ảnh hưởng tới chức năng enzyme của protein cytochrome b. Trong những bệnh nhân này, các đặc điểm lâm sàng bao gồm triệu chứng không dung nạp vận động tiến triển, yếu đầu chi, và một số trường hợp có myoglobin niệu. Khơng có tính di truyền theo dịng mẹ và khơng có đột biến trong các mơ ngồi mơ cơ. Sự xuất hiện các đặc điểm này được giải thích sự rối loạn là do đột biến ở tế bào soma trong các tế bào mầm sinh ra tế bào cơ sau q trình biệt hố lớp tế bào mầm (tế bào phôi). Tất cả những đột biến điểm này liên quan tới sự thay thế Adenine bởi Guanine, nhưng tất cả đều khác nhau về vị trí [95].
Keightley J.A. và cộng sự (2000) công bố rằng một báo cáo của Dumoulin đã đưa ra một bằng chứng đầu tiên về sự thiếu hụt phức hệ III được phân lập, trong đó có đột biến trong gen CYTB là cơ chế bệnh sinh của bệnh, sau đó 12 đột biến bệnh lý bổ sung khác ở trong gen này cũng được mô tả ở trong các nghiên cứu khác nhau [96]. Hầu hết các bệnh nhân xuất hiện các đặc điểm nổi bật là tình trạng khơng dung nạp vân động, thỉnh thoảng bao gồm cả triệu chứng yếu cơ và/ hoặc xuất hiện myoglobin niệu. Keightley J.A. đã điều tra lại một phụ nữ trẻ, đầu tiên được đưa ra bởi Kennaway, người phụ nữ này xuất hiện triệu chứng không dung nạp vận động và tăng acid lactic liên quan tới sự thiếu hụt nghiêm trọng phức hệ III và đáp ứng với liệu pháp điều trị bằng menadione và ascorbic. Bệnh nhân phát triển từ từ các triệu chứng của bệnh cơ do tổn thương não. Hoá tế bào miễn dịch của nhiều khu vực cơ đã chỉ ra một sự xơ hoá các sợi cơ, những sợi cơ này đáp ứng kém với các kháng thể của dưới đơn vị của phức hệ III nhưng đáp ứng bình thường
với kháng thể của dưới đơn vị của phức hệ I, II, hoặc IV [97]. Điều này được cho là do đột biến mtDNA. Kinh nghiệm này đã chứng minh giá trị chẩn đoán của phương pháp hoá tế bào miễn dịch trong việc chẩn đoán xác định những thiếu hụt của chuỗi hô hấp tế bào và khả năng phân biệt những thiếu hụt này được mã hoá do nhân và mtDNA. Keightley J.A. chứng minh đột biến ở bộ ba kết thúc (15242G-A) nằm trên gen CYTB, kết quả của đột biến này là làm mất 215 amino acid cuối cùng của cytochrome b. Đột biến này là đột biến dị tế bào chất (heteroplasmic) và xuất hiện trong 87% ở tổ chức cơ xương và thấp hơn (0,7%) trong máu. Những đột biến này cũng có mặt ở nhiều mơ khác, bao gồm cả chân tóc, cho thấy nó phải phát sinh rất sớm ở q trình phát triển bào phơi thai, trước q trình phân chia tế bào phơi ngun thuỷ, hoặc ngay cả dịng tế bào phơi của mẹ [96].
Trong các tế bào lấy từ bệnh nhân bị Parkinson và bệnh não do ty thể với tình trạng nhiễm acid lactic và có nhiều giai đoạn giống như đột quỵ (MELAS), những người này đã ẩn chứa một đột biến mất 4 cặp nucleotide trong gen CYTB. Rana M. và cộng sự (2000) tìm thấy tình trạng tổng hợp protein khơng đủ, q trình phosphoryl hố, q trình tổng hợp và hoạt động của phức hệ III thiếu hụt và tăng sản xuất hydrogen peroxide. Trong bệnh nhân này, CSF lactate trong huyết thanh tăng 10 lần, điều này có thể chứng minh q trình tích luỹ đột biến trong hệ thần kinh trung ương. Rana M. và cộng sự cho rằng đột biến mất 4bp có thể làm tăng ROS và tham gia vào một dạng kiểu hình khác nhau thơng qua một cơ chế khác từ quá trình giảm sản xuất năng lượng [98].
Legros F. và cộng sự (2001) đã phân tích gen CYTB ở 21 bệnh nhân mắc