Primer Cấu trúc
FIP
(Forward Inner Primer) :
Chứa đoạn F2 ở đầu 3' có trình tự bổ sung với đoạn F2c trên gen mục tiêu và một đoạn ADN có trình tự giống hệt đoạn F1c ở đầu 5'
BIP
(Backward Inner Primer) :
Chứa đoạn B2 ở đầu 3’ có trình tự bổ sung với đoạn B2c trên gen mục tiêu và một đoạn ADN có trình tự giống hệt đoạn B1c ở đầu 5'.
F3 Primer
(Forward Outer Primer)
: Chứa đoạn F3 có trình tự bổ sung với đoạn F3c trên gen mục tiêu.
B3 Primer
(Backward Outer Primer)
: Chứa đoạn B3 có trình tự bổ sung với đoạn B3c trên gen mục tiêu.
1.5.1.3. Cơ chế phản ứng
Chuỗi ADN xoắn kép đạt trạng thái cân bằng động học trong điều kiện nhiệt độ quanh khoảng 60- 65⁰C, do đó, chúng dễ dàng bị tách hai mạch đơn và tự hồi tính trở lại trong cùng điều kiện. Áp dụng tính chất này của chuỗi ADN kép, phản ứng LAMP được thiết kế để nhân đoạn gen mục tiêu trong điều kiện nhiệt độ như trên, trong đó đoạn mồi sẽ bắt cặp với trình tự ADN mục tiêu tại vị trí bắt cặp đặc hiệu. Quá trình khuếch đại gen diễn ra trong 2 giai đoạn lớn: giai đoạn khuếch đại các đoạn gen thẳng để hình thành các cấu trúc vịng (1-5) và giai đoạn khuếch đại các đoạn gen chứa cấu trúc vòng (5-11).
Phản ứng bắt đầu bằng đoạn F2 trên mồi FIP bắt cặp bổ sung với đoạn trình tự F2c trên đoạn ADN chứa gen mục tiêu (1) và bắt đầu quá trình kéo dài chuỗi (2) để hình thành chuỗi ADN mới có cấu trúc vịng ở đầu 3’ (4). Quá trình khuếch đại gen với F3 cũng theo cách tương tự, mồi F3 bắt cặp với vị trí F3c trên gen mục tiêu và quá trình tổng hợp đoạn ADN mới có cấu trúc như (3), thay thế đoạn ADN được tổng hợp bắt đầu từ FIP, đồng thời giải phóng đoạn này ra hỗn hợp phản ứng. Quá trình tổng hợp ADN với 1 sợi ADN khuôn là sợi đơn , và mồi BIP và B3 cũng theo cách thức tương tự như trên để hình thành đoạn trình tự chứa cấu trúc vịng ở cả hai đầu (5).
Giai đoạn thứ 2 của phản ứng bắt đầu với việc phản ứng sử dụng chính các cấu trúc vịng vừa được tổng hợp làm khn, q trình tổng hợp bắt đầu từ đầu 3’ của trình tự F1, và quá trình kéo dài bắt đầu từ FIP đến trình tự F2c của đoạn ADN đơn trong cấu trúc vòng tạo ra đồng thời cấu trúc (7) giống hệt (5) và cấu trúc (6) và (8) có chiều dài gấp đơi của (5). Hai cấu trúc mới này lại tiếp tục được sử dụng làm khn để hình thành ra các cấu trúc mới có chiều dài là bội số của cấu trúc vòng ban đầu. Kết quả của chuỗi phản ứng này là hình thành được một tập hợp các đoạn ADN có cấu trúc vịng ở hai đầu và có chiều dài chênh lệch nhau bằng chính chiều dài của đoạn ADN mục tiêu [98].
1.5.2. Phát hiện sản phẩm của LAMP
Sản phẩm của phản ứng khuếch đại có thể được phát hiện nhờ các chất chỉ thị được bổ sung trước hoặc sau phản ứng (Ethidium bromide, Hydroxy naphthol blue – HNB, Calcein hoặc PicoGreen), hoặc dựa vào sự tạo thành những hợp chất mới sau phản ứng (Magie pyrophosphate) và hiển thị sản phẩm khuếch đại thông qua điện di trên gel agarose và nhuộm bằng ethidium bromide.
1.5.2.1. Điện di
Điện di chính là phương pháp truyền thống nhất để quan sát và kiểm tra sản phẩm của phản ứng khuếch đại ADN. Đối với phản ứng LAMP, sản phẩm của quá trình khuếch đại gen sau khi điện di trên gel agarose và nhuộm với ethidium bromide sau đó soi dưới tia UV sẽ được hiển thị là tập hợp các băng ADN có kích thước chệnh lệch nhau bằng chính chiều dài của đoạn ADN mục tiêu (hình 9).
1.5.2.2. Hydroxy naphthol blue (HNB)
HNB là chất chỉ thị màu chỉ màu cho kim loại kiềm thổ (kim loại phân nhóm chính nhóm II trong bảng hệ thống tuần hồn). Chúng thuộc nhóm thuốc thử azo, có cấu trúc đặc trưng gồm hai gốc amin liên kết nhau tại vị trí của ngun tử nitơ (Hình 10), có tính năng đặc biệt là sẽ đổi màu khi thay đổi độ pH của mơi trường [70].
Hình 10. Cấu trúc phân từ HNB [70]
Chúng được sử dụng như một chất chỉ thị màu hiệu quả trong việc xác định chính xác nồng độ ion Ca2+ ở pH=13 và ion Mg2+ ở pH=10 [46]. Phương pháp này cũng được ứng dụng để nhận biết sự biến đổi hàm lượng canxi hoặc magie ở những giá trị pH nhất định. HNB có màu tím hoặc xanh tím ở nồng độ Mg2+ là 6 mM hoặc cao hơn và chúng tự động chuyển sang màu xanh lam khi nồng độ Mg2+ giảm xuống dưới 6 mM. Dựa vào tính năng đổi màu này, HNB được sử dụng làm chất chỉ thị cho phản ứng LAMP [37].
1.5.2.3. Calcein
Calcein, còn được gọi là fluorexon, là một thuốc nhuộm huỳnh quang được sử dụng nhiều trong các kỹ thuật lai huỳnh quang phân tử. Chúng nhận bước sóng kích thích 495 nm và phát xạ bước sóng 515 nm [84]. Chất này từng được sử dụng để xác định nồng độ ion Ca2+ hoặc Mg2+ theo nguyên lý như sau. Ban đầu, calcein được bổ sung cùng ion Mn2+ vào hỗn hợp phản ứng. Khi đó, ion Mn2+ bám trên bề mặt calcein làm ức chế quá trình phát xạ huỳnh quang của calcein khi có ánh sáng kích thích. Quá trình phản ứng xảy ra với sự tạo thành của pyrophosphate là sản phẩm phụ của phản ứng kéo dài chuỗi ADN, ion Mn2+ sẽ phản ứng với pyrophosphate để tạo chất kết tủa. Ion Mg2+ trong hỗn hợp thay thế vị trí của Mn2+, tăng cường sự phát xạ huỳnh quang của calcein (hình 11) [98].
Cs dc
Hình 11. Phát hiện sản phẩm LAMP dựa và chất chỉ thị huỳnh quang calcein [98]
1.5.2.4. Phát hiện dựa vào kết tủa
Trong phản ứng trùng hợp bởi ADN polymerase (1), ion pyrophosphate được tạo thành từ dNTP như một sản phẩm phụ. Ion pyrophosphate phản ứng với các ion Mg2+
trong hỗn hợp đệm tạo ra một kết tủa mới là Mg2P2O7 (2). Khi lượng kết tủa đủ lớn, nó làm đục dung dịch khiến chúng được phát hiện dễ dàng.
(DNA)n-1 + dNTP (DNA)n + P2O74- (1)
Mg2+ + P2O74- Mg2P2O7 (2)
Đặc biệt, khi bổ sung muối kali pyrophosphate vào dung dịch đệm phản ứng có chứa 4 mM MgSO4 và thực hiện phản ứng trong 60 phút ở 65°C, độ đục tăng lên đến mức có thể quan sát khi nồng độ thêm ion pyrophosphate vượt quá 0,5 mM [74].
1.5.3. Ưu điểm và nhược điểm của LAMP
1.5.3.1. Ưu điểm
Ưu điểm vượt trội của kỹ thuật LAMP so với các kỹ thuật khác thể hiện ở các tính năng chính: (1) phản ứng được thực hiện trong điều kiện đẳng nhiệt, (2) tính đặc hiệu rất cao và (3) hiệu quả khuếch đại lớn và số lượng bản copy đạt được rất nhiều [103]. Bên cạnh đó, (4) LAMP có độ nhạy rất tốt, phù hợp với chức năng chẩn đốn. Tất cả những tính năng đó giúp cho phản ứng LAMP được thực hiện một cách dễ dàng nhưng vẫn đảm bảo hiệu quả cao.
(1) Phản ứng được thực hiện trong điều kiện đẳng nhiệt
Đầu tiên, phản ứng LAMP có ưu điểm rất nổi bật là được thực hiện trong điều kiện đẳng nhiệt. Dưới tác dụng xúc tác của enzyme Bst, một enzyme có bản chất là 5’ ADN polymerase, và mặc dù thiếu chức năng 5’ exonuclease nhưng ngược lại, chúng chịu nhiệt tốt và có hoạt tính chuyển sợi, có khả năng tổng hợp sợi ADN mới ngay sau khi liên kết hidro ở chuỗi ADN khuôn bị đứt, mà khơng u cầu chuỗi ADN sợi kép phải biến tính hồn tồn [4]. Chính vì thế, phản ứng có thể xảy ra trong điều kiện đẳng nhiệt, ở nhiệt độ đủ để tách 1 phần chuỗi ADN sợi kép ban đầu. So với kỹ thuật PCR và các kỹ thuật phát triển từ PCR, với chu trình nhiệt phức tạp, gồm nhiều mức nhiệt độ khác nhau tương ứng với những giai đoạn khác nhau của phản ứng khuếch đại gen, cần những thiết bị kiểm sốt nhiệt độ một cách nghiêm ngặt thì đối với LAMP, địi hỏi về hệ thống thiết bị hiện đại và đắt tiền như máy chu trình nhiệt, là hồn tồn khơng cần thiết. Thay vào đó, mà bất kì dụng cụ nào đảm bảo được nhiệt độ cho phản ứng, là đảm bảo yêu cầu. Nói cách khác, LAMP là một kỹ thuật cực kì tiết kiệm, cực kì có lợi về mặt kinh tế trong nghiên cứu khoa học [32]. Hơn nữa, chính vì yếu tố không yêu cầu thiết bị điều chỉnh nhiệt độ chuyên dụng, phản ứng LAMP có thể dễ dàng thực hiện trong tất cả các điều kiện thí nghiệm – trong phịng thí nghiệm hoặc ngồi ruộng đồng [22, 42].
(2) Tính đặc hiệu rất cao
Phản ứng LAMP sử dụng hai cặp mồi khác nhau, trong đó, hai cặp mồi ngồi có độ dài tương tự như mồi cho phản ứng PCR và hai cặp mồi trong có độ dài gấp đơi cặp mồi phía ngồi. Việc kết hợp giữa hai cặp mồi khác nhau cho cùng một đoạn trình tự ADN mục tiêu làm cho phản ứng khuếch đại trở nên cực kì đặc hiệu. Hơn nữa, việc sử dụng cặp mồi dài để khuếch đại một đoạn gen có kích thước khơng q lớn (khoảng 200- 500 bp) làm cho sản phẩm của phản ứng gần như duy nhất.
(3) Hiệu quả khuếch đại rất lớn
Nhiệt độ tối ưu cho enzyme Bst ADN polymerase khoảng 60-65°C, tạo điều kiện ủ mồi và tăng cường khả năng chịu đựng các chất ức chế thường được tìm thấy trong các mẫu bệnh; đó là một lợi thế so với enzyme polymerase khác, làm cho phản ứng có thể đạt được hiểu quả cao nhất. Kết quả của một số nghiên cứu cho thấy, phản ứng LAMP có
hiệu quả khuếch đại ấn tượng mà chưa có bất kì kỹ thuật phân tử nào làm được. Phản ứng LAMP chỉ cần thực hiện trong thời gian từ 45-60 phút, có thể khuếch đại gen mục tiêu lên đến 109 lần [79]. Khơng chỉ dừng lại ở đó, phát triển từ phương pháp LAMP truyền thống, một phương pháp mới được cải tiến bằng cách thêm vào hai đoạn mồi bám vào trí trí ADN vịng, có thể làm giảm thời gian khuếch đại từ 1 giờ còn dưới 30 phút. Một lượng lớn kết tủa magie pyrophosphate được tạo thành như một sản phẩm phụ của sự khuếch đại, làm cho qua trình phát hiện hình ảnh trực tiếp nhanh hơn bao giờ hết mà không sử dụng bất kỳ chỉ số phản ứng và thiết bị phát hiện [74, 103]. Bên cạnh đó, khi kết hợp với phiên mã ngược, phương pháp này có thể cũng khuếch đại chuỗi RNA có hiệu quả cao [77]. Chính vì thế, LAMP đã cho thấy kết quả nổi bật của vượt hiệu suất của các phương pháp khuếch đại gen thông thường.
(4) Độ nhạy cao
Việc phát hiện một gen mục tiêu có mặt với lượng rất nhỏ trong một mẫu thực sự không hề dễ dàng. Là một phương pháp khuếch đại một gen mục tiêu, PCR được biết đến như một phương pháp phổ biến nhất, được áp dụng rộng rãi nhất, đóng vai trị chìa khóa trong các nghiên cứu sinh học phân tử, là một phương pháp phát hiện tuyệt vời nhờ độ nhạy cao dựa trên hiệu ứng khuếch đại theo cấp số nhân [79]. Tuy nhiên, so với PCR, kỹ thuật LAMP còn tỏ ra hiệu quả hơn nhiều, với lượng sản phẩm được nhân lên 109-1010 so với lượng ban đầu chỉ trong một thời gian 30-60 phút, ngắn chỉ bằng một nửa so với PCR [77]. Đánh giá hiệu quả khuếch đại gen, LAMP có độ nhạy cao hơn PCR từ 10-100 lần [15, 58, 65]. Thậm chí, khi được bổ sung thêm 2 mồi nữa, bắt cặp với trình tự ADN tạo cấu trúc vòng của sản phẩm, độ nhạy của phản ứng cịn tăng lên 10 lần so với khơng dùng cặp mồi này [64]. Hiệu quả của phản ứng thể hiện ở khả năng có thể phát hiện được trình tự ADN hoặc RNA mục tiêu với lương chỉ vài pictogram (1pg = 10-3 ng = 10-6 µg), thậm chí vài fetogram (1fg = 10-3 ng = 10-9 µg) [37].
(5) Tiện dụng
Phản ứng được thực hiện trong điều kiện đẳng nhiệt với một bước duy nhất làm cho việc thao tác trở nên hết sức dễ dàng. Kỹ thuật LAMP có thể được thực hiện với mẫu ADN không quá sạch, miễn sao không nhiễm ADN của những loài quá gần gũi hoặc mồi thiết kế khơng đặc hiệu cho lồi [22]. ADN làm khn cho phản ứng có thể được tách chiết bằng nhiều phương pháp khác nhau, thậm chí, chỉ cần tách chiết bằng các phương
pháp đơn giản như sử dụng NAOH kết hợp Tris-HCl và sử dụng dịch chiết thô làm nguyên liệu cho phản ứng [33]. Hơn thế, phản ứng vẫn có thể xảy ra trong điều kiện mẫu nhiễm protein mà không ảnh hưởng quá nhiều đến hiệu quả của phản ứng [56]. Đặc biệt, kỹ thuật LAMP tỏ ra cực kì tiện dụng vì có thể kiểm tra kết quả theo nhiều cách khác nhau (dùng chất chỉ thị màu, dựa vào lượng kết tủa) mà khơng nhất thiết phải điện di - hình thức truyền thống nhưng tốn nhiều thời gian - và an toàn hơn rất nhiều so với ethidium bromide, một hóa chất độc hại có thể gây đột biến và ung thư đường hô hấp được sử dụng làm thuốc nhuộm trong kỹ thuật điện di [70, 78]. Bên cạnh đó, LAMP cịn thể hiện được sử tiện dụng khi thao tác thiết kế mồi cho phản ứng, bước được đánh giá là phức tạp đã được đơn giản tối đa, tự động hóa và miễn phí hồn tồn trên trang web của cơ quan sáng chế ra kỹ thuật này [93].
Một cách tổng thể, nếu so sánh với PCR và các kỹ thuật phát triển từ PCR, điển hình là 2 kỹ thuật có độ nhạy cao là RT-PCR và real-time PCR, LAMP có nhiều ưu điểm vượt trội, nổi bật nhất là tính đơn giản và hiệu quả khuếch đại, độ nhạy cao và tính đặc hiệu tuyệt vời. Kỹ thuật LAMP đang thể hiện một công cụ khuếch đại gen mạnh mẽ phục vụ mục đích xác định nhanh chóng tác nhân gây bệnh cây trồng nói chung, đặc biệt là nhóm phytoplsama nói riêng [93].
Những đặc điểm riêng biệt của LAMP sẽ được thể hiện thơng qua bảng phân tích so sánh tính năng của nó với PCR (bảng 4)
Bảng 4. So sánh kỹ thuật LAMP và PCR [22]
PCR LAMP
Biến tính Yêu cầu biến tính hồn tồn đoạn ADN khn
Khơng cần biến tính hồn tồn ADN khn
Chu trình khuếch đại gen 3 giai đoạn riêng biệt với 3 nhiệt độ khác nhau
Đẳng nhiệt, sử dụng 1 nhiệt độ duy nhất
Thời gian thực hiện Từ 1,5-3 giờ Từ 0,5-1 giờ
Độ nhạy Vài nanogram Vài picogram đến fetogram
Kiểm tra sản phẩm Điện di Điện di, màu, kết tủa
Yêu cầu thiết bị Máy chu trình nhiệt Bể ổn nhiệt
1.5.3.2. Nhược điểm
Tuy có nhiều ưu thế nổi bật nhưng kỹ thuật LAMP cũng có những hạn chế thuộc về bản chất của nó. Đầu tiên, đoạn gen mục tiêu của LAMP thường là những đoạn ADN ngắn, sản phẩm của phản ứng là tập hợp những đoạn ADN có kích thước khơng giống nhau, và lượng khơng đồng đều nên không thể sử dụng làm vật liệu cho các nghiên cứu khác, giống như PCR [79].
Thiết kế mồi phức tạp: Mồi của phản ứng LAMP phải được thiết kế bằng phần mềm chuyên dụng, với chiều dài lớn gồm nhiều mồi khác nhau, gây khó khăn cho việc thiết kế, và dường như là điều không thể nếu áp dụng các phương pháp thiết kế mồi thơng thường. Tuy nhiên, đây cũng chính là đặc điểm tạo ra ưu thế đặc hiệu đặc trưng của phản ứng LAMP. Độ đặc hiệu cao trong nhận dạng một đoạn gen ngắn làm cho LAMP không phù hợp để nghiên cứu những gen mà chưa biết thông tin về nó, thay vào đó, cần nắm rất rõ đặc điểm cấu trúc của gen mục tiêu [24]
Enzyme riêng biệt, hóa chất riêng. Phản ứng LAMP được thực hiện trong điều kiện đẳng nhiệt, với một quy trình khác hồn tồn phản ứng PCR hay các phản ứng khác phát triển từ PCR, do đó, yêu cầu về thành phần hóa chất cho phản ứng này cũng khác biệt hồn tồn. Điều đó làm cho LAMP trở nên khơng thơng dụng như PCR, mặc dù điều đó làm nên đặc trưng riêng cho kỹ thuật LAMP.
Dễ nhiễm tạp: Phản ứng LAMP rất nhạy, và do đó, chỉ cần một lượng rất nhỏ đối tượng nghiên cứu của nó xuất hiện, chúng ngay lập tức được phát hiện dễ dàng. Tuy nhiên, điều đó cũng tạo ra một nhược điểm khá lớn của kỹ thuật LAMP. Do phản ứng rất