.3 Nguyên lí làm việc của LC-MS

Ứng dụng LC-MS [49].

Các hệ thống LC-MS có đợ nhạy cao, cung cấp định lượng chính xác với tốc đợ phân tích cao trong thực phẩm, dược phẩm, hóa học và phân tích mơi trường.

Kiểm tra lượng thuốc và chất độc: LC-MS được sử dụng phát hiện thuốc ức chế miễn dịch bao gồm tacrolimus, cyclosporin, everolimus, sirolimus và acid mycophenolic. Các phân tích tương tự đối với aminoglycosid, thuốc chống ung thư và thuốc kháng retrovirus. Steroid Hormones: Phân tích LC-MS rất hữu ích trong các phân tích steroid, trong khi các xét nghiệm miễn dịch truyền thống khơng hiệu quả. LC-MS có đợ nhạy cao đo mức dihydrotestosterone và testosterone thấp ở phụ nữ và trẻ em. Ngoài ra, LC-MS là một phương pháp ưu tiên để đo lường vitamin D và các chất chuyển hóa của nó. LC-MS phân tích cho 25-hydroxyvitamin D2 và D3 trong huyết

26

tương và huyết thanh và cho các vitamin tan trong chất béo như vitamin K15 và Vitamin E13,15[49].

1.6 Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

1.6.1 Định nghĩa

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân viết tắt là NMR (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy), thu được từ những phân tử có chứa hạt nhân có monen đợng lượng khác khơng. Phổ cợng hưởng từ hạt nhân là một trong các phương pháp vật lý quan trọng nghiên cứu cấu trúc phân tử, xác định thành phần hóa học trong mợt mẫu chất, nghiên cứu động học và cơ chế phản ứng [50].

1.6.2 Cơ sở vật lý của phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân

Theo thuyết cấu tạo nguyên tử, nguyên tử gồm có hạt nhân và lớp vỏ điện tích. Giả thuyết rằng hạt nhân có hình cầu có điện tích dương và mật đợ điện tích phân bố đồng đều trên mặt cầu. Một số loại hạt nhân hoạt đợng bằng cách tự quay quanh trục của chính nó vì hạt nhân mang điện tích dương nên chúng sẽ giống như mợt thanh nam châm nhỏ. Vì vậy chúng sẽ tương tác với từ trường bên ngồi. Khơng phải tất cả các hạt nhân mà chỉ có hạt nhân có số spin lẻ mới có đặc trưng này [51].

Nếu khơng có sự tác đợng của từ trường bên ngồi thì có spin hạt nhân của những hạt nhân có từ tính sẽ định hướng theo vơ số phương. Khi mẫu chất có chứa những hạt nhân này được đặt giữa hai cực của một cục nam châm mạnh (từ trường B0) các hạt nhân sẽ bị định hướng theo hướng của nam châm: song song cùng chiều hoặc song song ngược chiều với từ trường của nam châm. Khả năng đáp ứng với sự cộng hưởng từ của hai loại hạt nhân 1H và 13C không giống nhau. Tất cả các hạt nhân có số proton lẻ cũng như các hạt nhân có số noton lẻ đều có từ tính nên sẽ có hiện tượng cợng hưởng từ hạt nhân. Các hạt nhân có số proton và notron rỗng chẵn sẽ khơng có hiện tượng cộng hưởng từ hạt nhân [50], [51].

27

1.6.3 Độ dịch chuyển hóa học

Trên phổ đồ, vị trí mà mợt hạt nhân hấp thụ năng lượng để có hiện tượng cợng hưởng từ hạt nhân được gọi là đợ dịch chuyển hóa học. Theo quy ước, đợ dịch chuyển hóa học được chỉnh ở mức 0, trên phổ đồ và hấp thu tại vùng từ trường thấp hơn. Độ dịch chuyển hóa học của mợt hấp thu NMR sẽ là hằng số, không phụ thuộc vào lực từ trường và tần số hoạt đợng của máy. Lợi ích của việc đo phổ bằng máy có tần số là các hấp thụ được trải qua trong mợt khoảng từ trường lớn, vì thế nếu có các tín hiệu ở gần nhau có thể dễ dàng phân biệt được chúng. Trong khi, nếu đo bằng máy có tần số thấp thì các tín hiệu gần nhau có thể trùng lắp lên nhau gây khó quan sát. Đa số các proton của hợp chất hữu cơ đều có hấp thu trong khoảng 0-10 δ ppm trong vùng từ trường thấp so TMS và đa số các 13C của hợp chất hữu cơ đều có khoảng hấp thu từ 1 – 220 δ ppm trong vùng từ trường thấp so với TMS [52].

1.6.4 Các loại phổ một chiều của NMR

1.6.4.1 Phổ Proton (1H – NMR)

Phổ proton có thể xem là phổ có đợ nhạy cảm cao nhất trong kỹ thuật 1D – NMR vì hàm lượng 1H trong tự nhiên chiếm đến 99.98% (trong đó hàm lượng C-13 trong tự nhiên chỉ chiếm 1,108%). Vì thế đây là phổ quan trọng và có thể cung cấp nhiều thông tin quý về cấu trúc của hợp chất. Phổ 1H – NMR là một kỹ thuật sử dụng để xác định cấu trúc hóa học của hợp chất hữu cơ [53].

Phổ proton cho ta biết được số và loại proton có trong phân tử. Mỗi loại proton sẽ có tính chất khác nhau (như proton liên kết với vịng benzen sẽ khác với proton liên kết với Csp3) vì thế sẽ có đợ dịch chuyển khác nhau trên phổ proton.

Người ta sử dụng TMS (tetramethylsilan) làm chất chuẩn trong phổ proton và độ dịch chuyển của proton trong TMS được chọn là 0 ppm. Một điểm đặc biệt của phổ proton là ngoài cho biết loại proton trong phân tử, phổ còn cho biết mối quan hệ giữa các proton ở gần nhau thông qua sự ghép spin và hằng số ghép. Hai proton liên kết với hai cacbon kề nhau sẽ tương tác với nhau thông thường qua 3 liên kết H-C-C-H và

28

dạng mũi ghép spin sẽ theo ngun tắc (n+1) (ví dụ CH3-CH2- thì proton CH3- sẽ có dạng mũi 3 và proton CH2- sẽ có dạng mũi 4 do cạnh đó là ba proton) và sẽ có cùng hằng số ghép [53].

Độ dịch chuyển hóa học proton

Từ 0,8 đến 1,8 ppm: các proton trong vùng này thường liên kết với các nguyên tử C như các nhóm CH, CH2, CH3 nằm cách xa các nguyên tử âm điện. Các nhóm có nhiều proton gắn vào hơn sẽ bị che chắn nhiều hơn và sẽ xuất hiện ở trường cao hơn (gắn với TMS). Do đó, CH3 sẽ bị che chắn nhiều hơn nhóm CH2 và sẽ xuất hiện ở giá trị ppm thấp hơn.

Từ 1,8 đến 3,0 ppm: vùng này liên quan đến các proton nằm trên các nguyên tử C nằm cạnh các nhóm C=O, C=C và nhân thơm, như CH2-C=O, C=C-CH2- và CH2-Ar. Mợt dự đốn cho điều này là proton gắn trực tiếp với liên kết 3, CC-H, cũng xuất hiện trong vùng này.

Từ 3,0 đến 4,5 ppm: vùng này liên quan đến các proton nằm trên nguyên tử carbon được gắn trực tiếp với nguyên tử âm điện, thường là oxy hay nguyên tử halogen như các nhóm CH2-Cl, CH2-Br, CH2-O. Các nhóm chứa oxy thơng thường nhất là alcohol, ether và ester. Giá trị 3,5 ppm là tiêu biểu cho nhóm -O-CH3 hoặc –O-CH2-.

Từ 4,5 đến 7,0 ppm: vùng này liên quan đến các proton gắn trực tiếp với các carbon của liên kết đôi C=C trong alken (các proton vinyl) như C=C-H. Từ 6,5 đến 8,5 ppm: vùng này liên quan đến các proton gắn trực tiếp với carbon của liên kết đôi C=C trong vòng benzen hay các hơn chất thơm khác. Từ 9 đến 10 ppm: vùng này luôn luôn liên quan đến các proton aldehyt, các proton gắn trực tiếp với nhóm C-O [52], [53].

1.6.4.2 Phổ Carbon-13 (13C-NMR)

Phổ carbon 13-NMR có thể sử dụng xác định carbon khơng tương đương và nhận biết các nguyên tử carbon có thể có mặt trong hợp chất. Do đó phổ carbon 13-NMR cung cấp thông tin trực tiếp về bộ khung carbon của phân tử. Vị trí của các tín hiệu

29

cộng hưởng 13C rất quan trọng cho việc xác định cấu tạo các hợp chất. Bảng tương quan các vùng phổ cho thấy đợ chuyển dịch hóa học điển hình (được tính theo ppm từ TMS), các ngun tử C của các nhóm methyl ở TMS (mà khơng có hydro) được sử dụng làm so sánh [53].

Độ dịch chuyển hóa học carbon

Bảng 1.1 Đợ dịch chuyển hóa học của cacbon [53].

R-CH3 8-30 65-90 R2CH2 15-55 100-150 R3CH 20-60 C≡N 110-140 C-l 0-40 110-175 C-Br 25-65 155-185 C-N 30-65 155-185 C-Cl 35-80 185-220 C-O 40-80

Từ 10 đến 50 ppm: hầu hết các dung môi thông thường được sử dụng trong phổ NMR là CDCl3, xuất hiện ở dạng 3 pic có trung tâm ở 77 ppm. Các nguyên tử carbon-13 sp3 nói chung xuất hiện ở bên phải pic dung mơi này. Các nhóm CH3 bị che chắn nhiều hơn CH2 và thường xuất hiện ở các giá trị ppm nhỏ hơn so ở nhóm CH2.

Từ 35 đến 80 ppm: các nguyên tử âm điện gắn vào carbon gây nên sự chuyển dịch về phía từ trường yếu hơn như tương tự như quan sát ở phổ proton NMR. Các nguyên tử C trong nhóm này bao gồm: CH2-Cl, CH2-Br, CH2-O. Nguyên tử C trong nhóm

30

CC xuất hiện ở vùng 65 đến 80 ppm. Từ 110 đến 175 ppm: nhóm C=C trong alken và trong các hợp chất thơm xuất hiện ở phía bên trái của pic CDCl3, các nguyên tử carbon-13 thơm xuất hiện ở trường thấp hơn nữa so với alken, nhưng có 1 số trường hợp ngoại lệ và các peak carbon của các alken và hợp chất thơm che phủ nhau và xuất hiện trong một vùng phổ.

Từ 160 đến 220 ppm: nhóm cacbonyl xuất hiện ở phía trái xa nhất của phổ carbon- 13. Các nhóm C=C của ester và acid carboxyl xuất hiện ở vùng thấp hơn 160 đến 185 ppm), trong khi keton và aldehyt xuất hiện ở vùng cao hơn (185 đến 220 ppm). Các peak C=O này có thể tất yếu và đơi khi có thể bị mất [53].

1.6.4.3 Phổ DEPT

Để xác định được các loại cacbon có trong phân tử hợp chất hữu cơ. Hiện nay người ta sử dụng kỹ thuật DEPT- NMR. Kỹ thuật DEPT được thực hiện đồng thời cả hai kênh 1H và 13C một loại những xung phức tạp đã được chương trình hóa. Để có phổ này, người ta thực hiện bà lần ghi phổ khác nhau, trong đó có mợt lần gọi là DEPT- 45, cacbon nào có mang mợt hydro sẽ xuật hiện mợt mũi tên trên phổ đồ. Ngay sau đó mợt mợt lần ghi thứ hai gọi là DEPT-90, chỉ có những cacbon loại metyl > CH mới xuất hiện trên phổ đồ. Một lần ghi phổ thứ ba gọi lag DEPT-135 có những nhóm metyl-CH và metyl- CH3 sẽ xuất hiện trên phổ đồ những mũi dương hướng lên, cacbon metylen sẽ cho mũi hướng chiều ngược lại với mũi dương [53].

1.6.5 Các loại phổ hai chiều NMR

Đối với các hợp chất hữu cơ có cấu trúc đơn giản, chỉ cần 1H và 13C và DEPT chúng ta hồn tồn có thể xác định được. Tuy nhiên, với hợp chất có cấu trúc phúc tạp thì nếu chỉ sử dụng phổ 1H và 13C mợt chiều sẽ rất khó để giải đốn các tín hiệu cợng hưởng và xác định chính xác cấu trúc hóa học. Khi đó việc sử dụng phổ NMR hai chiều để giải đoán phổ sẽ dễ dàng hơn [53].

31

Phổ HSQC: cho thấy mối tương quan giữa proton và cacbon.

Phổ HMBC: cho thấy mối tương quan xa giữa hai, ba, hoặc bốn proton và cacbon.

Phổ NOSEY: mối tương quan giữa không gian của proton và proton.

1.6.6 Ứng dụng phổ NMR trong thực phẩm

Quang phổ NMR có thể được sử dụng để xác minh tuổi (sự lão hóa) và thành phần của rượu vang, hay xác định các thành phần chất béo của dầu. NMR cũng có thể được sử dụng để nghiên cứu các cơ chế phân hủy thực phẩm mà khơng cần phá hủy mẫu vì nó tân tiến với các kỹ thuật phân tích hóa học cổ điển [54].

Các kỹ thuật NMR có đợ phân giải cao đã tìm thấy các ứng dụng thú vị trong phân tích các hỗn hợp phức tạp của các chiết xuất khác nhau của các sản phẩm tự nhiên [55]. Hình 17 cho thấy việc xác định hợp chất chống oxy hóa acid rosmarinic trong phổ 1H NMR của chiết xuất etanolic của cây Origanum Vulgare. Acid Rosmarinic đã được báo cáo là một hoạt chất mạnh chống lại virus gây suy giảm miễn dịch ở người loại một (HIV-1) [56].

Hình 17. Phổ 1H- NMR của chiết xuất etanolic trong cây Origanum Vulgare. Các mũi tên biểu thị sự hiện diện của hợp chất chống oxy hóa acid rosmarinic [56]. Ngồi ra, cịn ứng dụng nhiều trong vi sinh, sinh học, hóa học và đặc biệt, NMR dử dụng tần số vô tuyến ứng dụng trong việc xác định các mơ khác nhau cũng như hình ảnh các cơ quan trong cơ thể. Đây là ứng dụng rất quan trọng trong y tế, được gọi

32

chuyên môn là Chụp cắt lớp, chụp cổng hưởng từ hay MRI mà ngày nay được ứng dụng rất nhiều[53].

1.7 Phương pháp sấy phun

Sấy phun là phương pháp chuyển từ các dạng dung dịch và huyền phù trong trạng thái phân tán thành dạng bột mịn như bột đậu nành, bột trứng, bột sữa, … hoặc các chế phẩm sinh học, dược liệu…

Nguyên lý hoạt động: Dung dịch cần sấy nhờ hệ thống bơm đưa vào bồn cao vị đặt trên đỉnh tháp sấy, nhờ bộ tán sương dung dịch được đưa vào tháp sấy và tán thành các giọt lỏng li ti. Chùm tia phun được dịng tác nhân nóng phân tán đều khắp thể tích tháp, rồi cùng chuyển động xuống đáy tháp, sản phẩm khô được thu gom tại đáy cyclon. Mợt phần bụi mịn theo khơng khí qua cyclon, sau đó qua bợ lọc vải nhằm thu hồi lại các hạt bụi mịn cịn sót lại và thải ra ngồi. Khơng khí nhờ quạt thổi qua bợ trao đổi nhiệt caloriphe và nâng lên nhiệt độ cần thiết theo u cầu của chế đợ sấy. Khơng khí trước khi qua bợ trao đổi nhiệt được lọc sạch bởi thiết bị lọc.

Trong sấy phun chất lượng sản phẩm cuối và hiệu quả bột phụ thuộc vào điều kiện hoạt đợng như nhiệt đợ khơng khí đầu vào và đầu ra, tốc đợ dịng cấp liệu, tốc độ hoặc áp śt ngun tử hóa, nồng đợ thức ăn, tỷ lệ thức ăn đến chất mang,…[54].

33

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Quả thể nấm Vân chi (Trametes Vesicolor) được thu nhận ở Vườn Quốc gia Pù Mát, Tỉnh Nghệ An, Việt Nam. Nấm được rửa sạch và làm khô, lưu trữ tại Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm trường ĐH Công Nghiệp TP.HCM.

2.1.2 Thiết bị và hóa chất

Hóa chất sử dụng chính là các dung mơi ethanol (96%), chloroform (CHCl3), n- hexane, ethyl acetate (EtOAc), methanol (MeOH) của Chemsol (Việt Nam). Bản mỏng (TLC) Silica gel F254 and Silica gel60 (diameter: 0.006-0.2 mm) của MERCK (Đức). Chi tiết được liệt kê trong 2 bảng sau:

34

Bảng 2.1 Thiết bị sử dụng nghiên cứu

STT Tên thiết bị và thiết bị Xuất xứ

1 Thiết bị cô quay chân không RV 10 IKA – Đức

2 Máy đo màu UV-VIS GENESYS Đức

3 Cân phân tích 4 số lẻ Sartorius CPA324S Nhật Bản 4 Cân kĩ thuật Sartorius - 27509411 Đức 5 Thiết bị sấy SHELLAB-USA-CE3F-2 Đức

6 Thiết bị lọc chân không Đức

7 Máy sấy tay Việt Nam

8 Phễu chiết Ấn Đợ

9 Cợt sắc kí Merck(Đức)

10 Đèn UV Đức

11 Kẹp gắp bảng mỏng Việt Nam

12 Ống mao quản (Capilary) chấm bản mỏng TLC Merck(Đức)

13 Bình thủy tinh nhỏ Việt Nam

14 Bể siêu âm UL Trasonic Cleaner -1617Y0831 Trung Quốc 15 Bể ổn nhiệt lạnh Bibby - R000100032 Anh

16 Máy sấy ẩm hồng ngoại Sartorius AG -

MA150C00023V1 Đức

17 Tủ sấy Memmert - C4121523 Đức

18 Máy đo quang phổ UV-VIS LABOMED –

UVS9060 Mỹ

35

Bảng 2.2 Hóa chất sử dụng nghiên cứu

STT Tên hóa chất Xuất sứ

1 Folin Merck(Đức) 2 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) Merck(Đức) 3 2,2’-azino-bis(3-ethybenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) Đức 4 6-hydroxy-2,5,7,8tetramethyl-2-carbocylic (Trolox) Đức

5 K2S2O8 Trung Quốc

6 Na2CO3 Trung Quốc

7 NaNO2 Trung Quốc

8 AlCl3 Trung Quốc

9 NaOH Trung Quốc

10 Vanillin Trung Quốc

11 Acid acetic Trung Quốc

12 Perchloric Acid Hàn Quốc

13 Etyl Acetate Trung Quốc

14 Phenol Trung Quốc

15 H2SO4 Trung Quốc

16 Etanol 98% Chemsol (Việt Nam)

17 n-Hexan Chemsol (Việt Nam)

18 Metanol Chemsol (Việt Nam)

19 Cetyl axetate Sigma Chemical (Mỹ)

20 Chlorofrom Sigma Chemical (Mỹ)

21 Silicagel Merck(Đức)

22 Bản mỏng (TLC) Merck(Đức)

36

2.2 Địa điểm và thời gian thực hiện

Địa điểm nghiên cứu: Phịng phân tích F4.3, F7.5, nhà F, Viện Cơng nghệ Sinh học

& Thực phẩm, Trường Đại học Cơng Nghiệp TP. Hồ Chí Minh.