CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.6. Đánh giá đặc trưng của vật liệu EBB cải tiến
2.6.3. Phương pháp xác định hiệu quả hấp phụ Amoni của vật liệu EBB cải tiến
nghiệm có dung tích 50 lít (Hình 2.5); dung dịch NaOH (5%) và H2SO4 (5%) được sử dụng để điều chỉnh pH. Thực nghiệm được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thường. Ở mỗi giai đoạn mới, nước thải trong bể thực nghiệm được thay mới. Chỉ tiêu COD được đo bằng phương pháp Dichromate sử dụng K2Cr2O7 làm tác nhân oxy hóa ( tiêu chuẩn ISO 6060:1989)
2.6.3. Phương pháp xác định hiệu quả hấp phụ Amoni của vật liệu EBB cải tiến tiến
Thực nghiệm
Dung dịch NH4Cl được chuẩn bị trong nước cất bão hồ khí Ar. Vật liệu EBB cải tiến trước khi hấp phụ ion Amoni được xử lý bề mặt trong bể siêu âm trong 15 phút. Quá trình hấp phụ được thực hiện với các nồng độ dung dịch ban đầu, pH và lượng chất hấp phụ xác định, tùy theo thí nghiệm, dung dịch NaOH 0.1M và HCl 0.1M để điều chỉnh pH. Các mẫu được lắc trên máy lắc rung tốc độ 120 vịng /phút. Sau đó li tâm, lọc lấy dung dịch để phân tích lượng ion Amoni cịn lại.
Để nghiên cứu khả năng hấp phụ ion Amoni của vật liệu, thực hiện dãy thí nghiệm sau:
- Ảnh hưởng của pH đến khả năng hấp phụ ion Amoni của vật liệu:
Chuẩn bị 9 mẫu dung dịch có nồng độ ion NH4Cl 30 mg/L, khối lượng vật liệu hấp phụ 150 g/L. Giá trị pH của các mẫu thí nghiệm được chỉnh lần lượt là 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ,9 và 10.
- Động học hấp phụ ion Amoni và ảnh hưởng của nồng độ ban đầu đến hiệu quả hấp phụ của vật liệu:
Dung dịch NH4Cl có nồng độ NH4+ ban đầu là 10, 30, 45 mg/L, khối lượng rắn 150 g/L, duy trì pH 6. Thời gian lấy mẫu lần lượt là: 30, 60, 90, 120,150, 180, 240, 360, 480 và 720 phút.
Để nghiên cứu động học hấp phụ của ion N trên vật liệu EBB cải tiến, hai mơ hình động học được khảo sát:
Mơ hình động học biểu kiến bậc nhất:
ln (qe – qt) = lnqe – K1.t (2.1)
Mơ hình động học biểu kiến bậc hai:
𝑡
𝑞𝑡 = 1
K2.𝑞𝑒2+ 𝑡
𝑞𝑒 (2.2)
Trong đó:
qe (mg/g): lượng NH4+ bị hấp phụ tại trạng thái cân bằng qt (mg/g): lượng NH4+ bị hấp phụ tại thời điểm t (phút) K1 (phút-1): hằng số tốc độ biểu kiến bậc nhất
K2 (mg/g. phút1/2): hằng số tốc độ biểu kiến bậc hai. - Ảnh hưởng của lượng chất hấp phụ:
Dung dịch NH4Cl có nồng độ ban đầu là 30 mg/L, nồng độ hấp phụ được sử dụng lần lượt là 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 và 500 g/L, pH tại 6. Thời gian lấy mẫu là sau 240 phút tiếp xúc.
- Đẳng nhiệt hấp phụ ion Amoni của vật liệu:
Tiến hành thí nghiệm với các điều kiện sau: Hàm lượng rắn là 150 g/L, nồng độ NH4Cl ban đầu lần lượt là: 10, 16, 20, 25, 30, 45, 50 và 60 mg/L; pH được kiểm soát tại giá trị là 6. Thời gian tiếp xúc là 240 phút.
Xác định các hằng số của phương trình đẳng nhiệt hấp phụ Langmuir:
(2.3)
Trong đó:
q – Dung lượng hấp phụ tại thời điểm đạt cân bằng (mg/g) qmax – Dung lượng hấp phụ cực đại (mg/g)
b - Hằng số đặc trưng cho tương tác của chất hấp phụ và chất bị hấp phụ. Phương trình này có thể chuyển thành dạng:
max max . 1 . 1 q b C q q C f f = + (2.4)
Đây là phương trình đường thẳng biểu thị sự phụ thuộc tuyến tính của Cf /q vào Cf.
Trong đó:
qe Dung lượng hấp phụ khi đạt cân bằng (mg/g).
qmax Dung lượng hấp phụ cực đại (mg/g). Cf Nồng độ lúc cân bằng (mg/L).
b Hằng số đặc trưng cho tương tác của chất hấp phụ và chất bị hấp phụ.
- Phân tích xác định hàm lượng ion Amoni
Nồng độ ion Amoni trong nước được xác định bằng phương pháp đo màu với thuốc thử Nessler.
Trong môi trường kiềm NH4+ tác dụng với thuốc thử Nessler tạo thành phức có màu từ vàng đến nâu, phụ thuộc vào nồng độ Amoni trong dung dịch.
Yếu tố cản trở: sắt gây cản trở xác định, được loại bỏ bằng muối xenhet complexon (III). Các hợp chất hữu cơ, các ancol, andehyt, các amin béo vào thơm, các cloramin phản ứng với thuốc thử Nessler, khi có mặt chúng trong nước phải chưng cất để tách Amoni trước khi xác định. Trong trường hợp nước đục phải xử lý bằng dung dịch kẽm sufat 25%.
Cách xác định: lấy 5 ml mẫu, thêm tương ứng 0,2 ml xenetic và 0,5 ml dung dịch Nessler. Để yên trong 10 phút, sau đó tiến hành đo hấp phụ quang ở bước sóng 420 nm.
(2.5)
Trong đó:
Co: nồng độ chất bị hấp phụ ban đầu (mg/L)
Ce: nồng độ chất bị hấp phụ tại thời điểm lấy mẫu (mg/L).
2.6.4. Phương pháp xác định hiệu quả hoạt động VSV trong EBB cải tiến bằng kỹ thuật sinh học phân tử
Hệ thực nghiệm theo dõi mật độ VSV trong vật liệu EBB cải tiến bằng kỹ thuật sinh học phân tử được bố trí trong Hình 2.6.
Hình 2. 6. Hệ thực nghiệm đánh giá hoạt động của VSV trong vật liệu EBB cải tiến
(i) Máng nước A1: Có vật liệu EBB cải tiến; có cấy VSV từ chế phẩm Sagi-Bio 2; có cấp khí.
(ii) Máng nước A2: Có vật liệu EBB cải tiến; khơng cấp khí; có cấy VSV từ chế phẩm Sagi-Bio 2
(iii) Máng nước A3: Có vật liệu đệm xốp đối chứng, có cấy VSV từ chế phẩm Sagi-Bio 2, có cấp khí
(iv) Máng nước A4: không vật liệu EBB cải tiến, không cấy VSV, khơng cấp khí,
(v) Máng nước A5: Khơng có vật liệu EBB, khơng cấy VSV, có cấp khí Nước thải sinh hoạt được lấy tại một cống ở phường Nghĩa Đô, quận Cầu Giấy, Hà Nội được mang về chạy thực nghiệm. Nước thải sinh hoạt được đựng trong thùng có dung tích 200 lít. Tại đây, có 05 bơm định lượng được điều chỉnh lưu lượng như nhau. Nước thải từ 05 bơm định lượng được chia đều vào trong 05 máng nước của hệ thực nghiệm. Nước thải được phân tích và xác định các chỉ tiêu như COD, Amoni hàng ngày và sau 10 ngày thì lấy mẫu đi phân tích đánh giá quần xã vi sinh trong các mẫu thử nghiệm bằng kỹ thuật sinh học điện di biến tính DGGE.
- Kỹ thuật tách DNA
Với mục đích là phân tích sự đa dạng quần xã vi khuẩn trong vật liệu EBB cải tiến trước và sau khi cấy các chủng VSV ở trong chế phẩm Sagi-Bio 2.
+ Xử lý mẫu
• Mỗi mẫu vật liệu lọc được ngâm trong nước MQ vô trùng, dùng tác động cơ học tác động mạnh làm cho các tế bào VSV bám trên bề mặt vật liệu lọc hòa tan vào nước nhằm thu được tối đa lượng tế bào VSV bám trên bề mặt của vật liệu lọc.
• 2 mL mỗi mẫu nước thu được ở trên được ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng để thu cặn tế bào.
• Bổ sung 1 ml nước MQ vô trùng vào mỗi ống, khuấy tan cặn tế bào sau đó tiếp tục ly tâm 6000 vịng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng (để rửa mẫu).
ã Hỳt b phn dch. B sung 300 àl nước MQ vô trùng vào mẫu, khuấy cho phần cặn hịa tan lại.
+ Tách DNA tổng số
• Bổ sung 300 µL hỗn hợp Phenol-Chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) khuấy kỹ bằng vortex hoặc dùng tay trong khoảng 30 giây.
• Ly tâm ở 14000 v/p, RT, trong 12ữ15 phỳt.
ã Dùng pipet nhẹ hút pha dịch nổi trên cùng và chuyển sang 1 ống eppendor khác (khong 200 àL).
ã B sung theo th t: 1 µL Glycogen, 100µl ammonium acetate 7,5M và 750µl Ethanol 100%.
• Ủ trong ngăn đá (- 20oC) qua đêm
• Ly tâm ở 14000 v/p, 4oC trong 30 phút để ta DNA.
ã Gn b phn dch, b sung 150àl ethanol 70%, mix nhẹ bằng pipet.
• Ly tâm ở 14000 v/p, 4oC trong 10 phút để rửa DNA. Lặp lại bước này 2 lần.
• Gạn bỏ phần dch, kh.
ã B sung 20 àl nc PCR vào để hịa tan DNA.
• Chuẩn bị dung dịch - Kỹ thuật điện di DGGE
Chuẩn bị dung dịch biến tính
Bảng 2. 5. Tỷ lệ các dung dịch biến tính để tiến hành thực nghiệm.
Stock solutions 45% biến tính 60% biến tính 0% biến tính
60% - dung dịch 7,5 mL 10 mL 0 mL 0% - dung dịch 2,5 mL / 5 Ml TEMED 8 µL 8 µL 5µL APS 10% 40 L 40µL 22L Các bước tiến hành: + Lắp khuôn gel.
+ Hút 2 ml dung dịch biến tính (45% và 60%) vào dụng cụ đổ gel, 60% đặt bên phải (có đầu ra), 45% phía bên trái, mở các van, đặt kim vào khoảng giữa của tấm kính (để solutions chạy đều bên trong).
+ Bật công tắc pumper, đặt ở tốc độ bơm nhỏ nhất. Sau khi hết 2 dung dịch 60% và 45% để khoảng 30 phút cho khô.
+ Đặt lược vào giữa 2 tấm kính, dùng pipet tra 0 % solution vào nhẹ nhàng và tránh gây bóng khí.
+ Để bản gel ổn định sau 3 giờ.
+ Bật thiết bị điện di khoảng 1 giờ, đạt tới 60oC trước khi tiến hành.
+ Rút lược ra khỏi bản gel, rửa sạch từng giếng bằng pipet, kiểm tra chất lượng giếng bằng cách nhỏ Loading dye đã pha loãng vào các giếng. Đặt bản gel vào buồng điện di.
+ Mix Loading dye với các mẫu (7µl +10 µl mẫu). Dùng pipet nhỏ từng mẫu lần lượt vào các giếng từ trái qua phải.
+ Bật nguồn điện, chạy 120 V trong 30 phút để hỗn hợp mẫu-loading dye đi vào bản gel, sau đó điện di ở hiệu điện thế 38 V/16 giờ (từ 17h30÷9h30 hơm sau)
+ Đưa bản gel ra, tháo tấm kính và đánh dấu bằng cách cắt 1 góc nhỏ phía dưới bản gel.
+ Nhuộm gel trong 30 phút trong dung dịch nhuộm GreenSafe, rửa lại bằng nước cất 10 phút.
+ Đưa bản gel lên bàn soi gel, quan sát và chụp ảnh.