ở vƣờn ƣơm.
3.5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Xác định nguyên nhân gây bệnh bệnh
- Thu thập mẫu bệnh.
Phƣơng pháp tiến hành là điều tra sơ bộ toàn bộ khu vực bị bệnh. Chọn các mẫu lá, hoặc cành bị bệnh có triệu chứng đ iển hình cắt và đƣợc gói trong giấy báo. Mẫu bệnh đƣợc đựng trong các túi giấy ghi số mẫu và mô tả một số các đặc điểm của khu vực thu mẫu.Trong quá trình thu thập mẫu lá, thân bị bệnh, bảo quản không bị dập nát.
- Phƣơng pháp mô tả triệu chứng bệnh.
Cần phải xác định bộ phận bị bệnh: lá, thân hay rễ. Mô tả đặc điểm về màu sắc, kích thƣớc của vết bệnh. Sử dụng kính lúp cầm tay có độ phóng đại
10 lần quan sát bề mặt vết bệnh, mô tả màu sắc, hình dạng của thể quả nấm bệnh. Đƣa mẫu lá, thân bị bệnh lên kính hiển vi soi nổi, quan sát các đặc điểm về thể quả nấm bệnh và khối bào tử vô tính (conidial mass) đƣợc phun ra từ thể quả nấm bệnh khi gặp điều kiện ẩm. Sau đó chụp ảnh và ghi số hiệu đối với các mẫu bệnh.
- Giám định nguyên nhân gây bệnh
Với những trƣờng hợp trên lá, thân bệnh chƣa xuất hiện cơ quan sinh sản của nấm bệnh thì ta dùng phƣơng pháp để ẩm của Noumow, vì khi có độ ẩm cao sợi nấm sẽ mọc ra ngoài, tổ chức bị bệnh sẽ hình thành c ơ quan sinh sản. Các mẫu lá, cành bị bệnh đƣợc thu thập về, bảo quản mẫu không
ẩm. Đặt các hộp lồng ở nhiệt độ 280C, sau khoảng 28-48 giờ các khối bào tử
vô tính của nấm bệnh nổi lên từ thể quả của nấm trên các tổ chức của bệnh.
Để quan sát bào tử của nấm bệnh ta tiến hành nhƣ sau: Nhỏ giọt nƣớc cất lên lam kính, đƣa mẫu lá, thân bị bệnh lên kính soi nổi, dùng que cấy lấy thể quả cho vào lam kính, có nƣớc đậy la men, đƣa mẫu lên kính hiển vi phản pha BX50 có độ phóng đại tối đa 2000 lần để quan sát bào tử nấm bệnh. Trong quá trình quan sát tiến hành mô tả những đặc điểm hình thái về cấu tạo, hình dạng, kích thƣớc, màu sắc bào tử.
Căn cứ vào triệu chứng của bệnh, hình dạng kích thƣớc của thể quả nấm gây bệnh, hình dạng kích thƣớc của bào tử nấm gây bệnh, đối chiếu với các chuyên khảo về vi nấm của Crous P.W., Ferreira, F.A. và Sutton B. 1997; chuyên khảo về nấm túi của Richard T. Hanlin, 1992 .
- Phƣơng pháp phân lập vật gây bệnh
Để có thể phân lập đƣợc VGB ta chuẩn bị môi trƣờng
Môi trƣờng PDA Khoai tây: 200 gam D – Glucose: 20 gam Agar : 18 gam
Nƣớc cất: 1000ml
Khoai tây rửa sạch sau đó cắt thành từng miếng có kích thƣớc ( 1x 1x 1) cm sau đó cho vào nồi và đổ nƣớc 1000ml đun sôi, sau khi sôi để nguội trong 30 phút, lọc lấy nƣớc trong, sau đó cho thêm nƣớc vào vừa đủ 1000ml. Cho D- Glucose và Agar vào các bình tam giác 500ml, nút bông, cuốn giấy đầu cổ bình (3 bình, mỗi bình 330ml), hấp khử trùng ở mô i trƣờng 1210C
(tƣơng đƣơng 1atm) trong 30 phút. Sau đó đổ ra hộp lồng để trong tủ cấy.
Tiến hành phân lập: Các mẫu thu thập về cắt các tổ chức lá bị bệnh thành các đoạn ngắn 2-3cm, sau đó đặt các mẫu bệnh rửa sạch cho vào hộp lồng để ẩm, sợi nấm mọc từ các tổ chức bị bệnh. Sau khi nấm mọc tiến hành phân lập bằng cách dùng que cấy cấy truyền các mầm bệnh sang môi trƣờng dinh dƣỡng mới. Khi thấy sợi nấm đã mọc tốt, không bị lẫn tạp vớí các loài nấm khác thì đƣợc coi là thuần khiết.
- Thí nghiệm gây bệnh nhân tạo
Việc gây GBNT giúp cho ta khẳng đ ịnh đƣợc nấm mà ta phân lập đƣợc từ các tổ chức bị bệnh có chính xác hay không.
Phương pháp: Lấy các bào tử từ hệ sợi bằng que cấy đƣợc khử trùng trên ngọn đèn cồn. Pha bào tử trong nƣớc cất vô trùng có mật độ 1 x 106 tế bào/ ml. Nhúng các mẫu lá, thân vào cốc nƣớc dung dịch bào tử, sau đó để vào trong hộp lồng ẩm băng keo lại xung quanh hộp. Mỗi hộp ta để khoảng 2
-3 lá. Thí nghiệm đƣợc tiến hành với 10 hộp lồng, 3 lần lặp, theo dõi thời gian xuất hiện triệu chứng và kiểm tra bào tử trên các lá gây bệnh nhân tạo.