a. khí clo 16 giờ, b. Khí clo 24 giờ, c. Dung dịch Javel 50% 30 phút, d. Dung dịch Javel 50% 40 phút, e. Dung dịch Javel 50% 50 phút
ảng 3.3. Tỉ lệ hạt đậu tƣơng không nhiễm và nảy mầm khi khử trùng bằng dung
dịch Javel hoặc khí clo. Tác nhân khử trùng,
thời gian
Tỉ lệ hạt khơng nhiễm (%)
Tỉ lệ hạt không nhiễm nảy mầm (%)1 HL 07-15 OMĐN 29 HL 07-15 OMĐN 29 Khí clo, 16 giờ 100 100 94,44 a 91,67 a Khí clo, 24 giờ 100 100 52,78 c 66,67 bc Javel 50%, 30 p 97,22 94,44 83,33 b 86,11 a Javel 50%, 40 p 100 100 75,00 b 77,78 ab Javel 50%, 50 p 100 100 52,78 c 50,00 c
Các chữ cái khác nhau (a, b, c…) trên cùng một cột biểu diễn sự khác biệt có ý nghĩa với P ≤ 0,05 theo kiểm định thống kê LSD. Số liệu (1) đã được chuyển đổi sang dạng arcsin√x trước khi xử lý thống kê.
3.3. Ảnh hƣởng của BA lên sự tái sinh của đốt lá mầm và một nửa hạt
Nghiên cứu khả năng cảm ứng tạo chồi bất định của BA ở các nồng độ khác nhau đƣợc thực hiện trên 3 giống MTĐ 176, HL 07-15, OMĐN 29 với 2 qui cách mẫu đốt lá mầm (QC1) và một nửa hạt (QC2).
Nhìn chung sự cảm ứng chồi của BA với hai loại mẫu của cả ba giống đậu tƣơng khảo sát khá giống nhau (bảng 3.4, 3.5, 3.6). Ở các nghiệm thức đối chứng không bổ sung BA, tất cả mẫu đều không tạo chồi, một số mẫu hình thành rễ. Trên mơi trƣờng bổ sung từ 0,5 đến 2 mg/l BA, khả năng tạo chồi của mẫu đốt lá mầm và một nửa hạt đều tăng dần theo nồng độ BA. Ở nồng độ 2 mg/l BA, cả 2 loại mẫu của ba giống đều có mức tạo chồi tối ƣu về tỉ lệ mẫu tạo chồi (trên 90%) và số chồi trung bình/mẫu, giống MTĐ 176 (QC1: 4,83; QC2: 5,13); HL 07-15 (QC1: 5,17; QC2: 5,30); OMĐN (QC1: 5,03; QC2:5,10), chồi hình thành đồng đều, ít mơ sẹo (hình 3.3, 3.5, 3.6, 3.7). Khi tăng nồng độ BA lên 2,5-3 mg/l, ở giống MTĐ 176 khả năng tạo chồi của mẫu giảm cả về tỉ lệ mẫu tạo chồi và số chồi trung bình/mẫu; giống HL 07-15 và OMĐN 29 tuy tỉ lệ mẫu tạo chồi không thay đổi nhiều nhƣng số chồi trung bình/mẫu giảm dần. Đồng thời, ở cả ba giống, hình thái chồi nhận đƣợc khơng đồng đều, nhiều mẫu có mơ sẹo trắng xốp hình thành (hình 3.4).
ảng 3.4. Ảnh hƣởng của các nồng độ BA lên sự tái sinh của đốt lá mầm và một nửa
hạt giống MTĐ 176
Nồng độ BA (mg/l) Tỉ lệ mẫu tạo chồi (%)1 Số chồi/mẫu2
QC1 QC2 QC1 QC2 0 0,00 e 0,00 e 0,00 f 0,00 f 0,5 33,33 d 36,67 d 0,6 ± 0,17 e 0,67 ± 0,15 e 1 40,00 d 43,33 d 1,07 ± 0,21 d 1,20 ± 0,26 d 1,5 63,33 c 73,33 c 2,20 ± 0,36 c 2,63 ± 0,35 c 2 93,33 a 96,67 a 4,83 ± 0,59 a 5,13 ± 0,57 a 2,5 90,00 a 86,67 b 4,03 ± 0,40 a 4,00 ± 0,36 b 3 76,67 b 73,33 c 2,90 ± 0,36 b 2,43 ± 0,32 c
Các chữ cái khác nhau (a, b, c…) trên cùng một cột biểu diễn sự khác biệt có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong phép thử Duncan. Số liệu (1) đã được chuyển đổi sang dạng arcsin√x; số liệu (2) được chuyển sang dạng log(x+1) trước khi xử lý thống kê.
Hình 3.3. Sự hình thành chồi của đốt lá mầm giống MTĐ 176
ở các nồng độ BA khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy.
a, b, c, d, e, f, g: đốt lá mầm tái sinh trên mơi trường có 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3 mg/l BA. Hình 3.4. Sự đáp ứng của đốt lá mầm và một nửa hạt của
giống MTĐ 176 ở các nồng độ BA khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy.
a, b, c: đốt lá mầm trên mơi trường có BA 0; 2; 3 mg/l; d, e, f: một nửa hạt trên mơi trường có BA 0; 2; 3 mg/l.
Hình 3.5. Sự hình thành chồi của mẫu một nửa hạt
giống MTĐ 176 ở các nồng độ BA khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy.
a, b, c, d, e, f, g: đốt lá mầm tái sinh trên mơi trường có 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3 mg/l BA. ảng 3 5. Ảnh hƣởng của các nồng độ BA lên sự tái sinh của đốt lá mầm và một
nửa hạt giống HL 07-15
Nồng độ BA (mg/l) Tỉ lệ mẫu tạo chồi (%)1 Số chồi/mẫu2
QC1 QC2 QC1 QC2 0 0,00 e 0,00 e 0,00 e 0,00 e 0,5 36,67 d 40,00 d 0,70 ± 0,17 d 0,77 ± 0,15 d 1 53,33 c 56,67 c 1,57 ± 0,21 c 1,67 ± 0,25 c 1,5 76,67 b 73,33 b 2,73 ± 0,35 b 2,77 ± 0,31 b 2 96,67 a 96,67 a 5,17 ± 0,55 a 5,30 ± 0,56 a 2,5 96,67 a 93,33 a 4,87 ± 0,47 a 4,80 ± 0,53 a 3 93,33 a 96,67 a 4,50 ± 0,46 a 4,77 ± 0,65 a
Các chữ cái khác nhau (a, b, c…) trên cùng một cột biểu diễn sự khác biệt có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong phép thử Duncan. Số liệu (1) đã được chuyển đổi sang dạng arcsin√x; số liệu (2) được chuyển sang dạng log(x+1) trước khi xử lý thống kê.
Hình 3.6. Sự hình thành chồi của đốt lá mầm giống HL 07-15
ở các nồng độ BA khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy.
a, b, c, d, e, f, g: đốt lá mầm tái sinh trên mơi trường có 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3 mg/l BA. ảng 3.6. Ảnh hƣởng của các nồng độ BA lên sự tái sinh của đốt lá mầm và một
nửa hạt giống OMĐN 29
Nồng độ BA (mg/l) Tỉ lệ mẫu tạo chồi(%)1 Số chồi/mẫu2
QC1 QC2 QC1 QC2 0 0,00 e 0,00 e 0,00 e 0,00 e 0,5 36,67 d 40,00 d 0,57 ± 0,15 d 0,67 ± 0,12 d 1 53,33 c 63,33 c 1,43 ± 0,25 c 1,67 ± 0,25 c 1,5 76,67 b 76,67 b 2,87 ± 0,40 b 2,93 ± 0,35 b 2 96,67 a 96,67 a 5,03 ± 0,51 a 5,10 ± 0,56 a 2,5 96,67 a 93,33 a 4,63 ± 0,45 a 4,80 ± 0,44 a 3 93,33 a 96,67 a 4,27 ± 0,55 a 4,70 ± 0,53 a
Các chữ cái khác nhau (a, b, c…) trên cùng một cột biểu diễn sự khác biệt có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong phép thử Duncan. Số liệu (1) đã được chuyển đổi sang dạng arcsin√x; số liệu (2) được chuyển sang dạng log(x+1) trước khi xử lý thống kê.
Hình 3.7. Sự hình thành chồi của đốt lá mầm giống OMĐN 29
ở các nồng độ BA khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy.
a, b, c, d, e, f, g: đốt lá mầm tái sinh trên mơi trường có 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3 mg/l BA.
Nhƣ vậy, cả mẫu đốt lá mầm và nửa hạt trên 3 giống đều có khả năng đáp ứng tái sinh tốt với sự kích thích tạo chồi bất định của BA. Nồng độ BA tối ƣu với cả 3 giống trên đốt lá mầm và nửa hạt là 2 mg/l. Khả năng đáp ứng tái sinh của hai loại mẫu, một nửa hạt và đốt lá mầm, trên cả 3 giống khá giống nhau. Điều này có thể do bản chất của vùng tái sinh trên đốt lá mầm và một nửa hạt giống nhau, đều là vùng mô phân sinh bên (nách). Sự khác nhau về cách xử lý mẫu, thời gian nuôi mẫu (đốt lá mầm từ cây nảy mầm 5 ngày, một nửa hạt từ hạt ngâm trong nƣớc 20 giờ) không ảnh hƣởng nhiều đến khả năng tái sinh của vùng này.
Nhiều nghiên cứu trên các giống đậu tƣơng khác nhau cũng ghi nhận nồng độ BA tối ƣu cảm ứng tạo chồi từ đốt lá mầm khoảng 2 mg/l [111][127][129]. Khi
sử dụng nồng độ BA tối ƣu, khả năng tạo đa chồi đƣợc ghi nhận khác nhau giữa các giống, nhƣ giống Incasoy-36 (Cuba) có 96,8% mẫu tạo chồi với 4,3 chồi/mẫu [104], giống JS335 (Ấn Độ) có 53,33% mẫu tạo chồi, với 4,66 chồi/mẫu [101], một số giống Trung Quốc có 97,2% mẫu tạo chồi với 13 chồi/mẫu [102]. Hiện tƣợng khi tăng nồng độ quá mức tối ƣu, ảnh hƣởng không tốt đến khả năng tạo chồi cũng đƣợc nhiều tác giả ghi nhận nhƣ Janani và Kumari (2013) khi tăng nồng độ BA từ 15 µM lên 20 µM và 25 µM tỉ lệ tạo chồi và số chồi/mẫu đều giảm từ 53,3% xuống 50% và 43,3% [101]. Soto và cộng sự (2013) cho biết khi tăng nồng độ BA tối ƣu từ 1,5 mg/l lên 2; 3; 6 mg/l, tỉ lệ mẫu tạo chồi và số chồi/mẫu đều giảm [104]. Hiện tƣợng tạo mô sẹo nhiều ở vùng trụ dƣới lá mầm khi sử dụng nồng độ BA cao cũng đƣợc ghi nhận bởi Ma và Wu (2008) [102]. Trên một số giống cây khác dùng BA để cảm ứng tạo chồi trực tiếp từ mô phân sinh cũng ghi nhận các kết quả tƣơng tự, khi dùng BA ở nồng độ thích hợp sẽ kích thích tạo chồi, khi tăng cao dẫn đến tạo nhiều mô sẹo nhƣ trên cumin (thì là) ở 0,2 mg/l kích thích tạo và nhân chồi, cịn 0,9 mg/l kích thích tạo mơ sẹo [166]. Trên giống cam chua (Citrus aurantium) tái sinh chồi dùng BA cũng ghi nhận khi dùng BA 1 mg/l cảm ứng tạo chồi tốt nhất với 6,7 chồi/mẫu, khi tăng BA lên 2 và 3 mg/l dẫn đến khả năng cảm ứng chồi giảm cịn 2,3 và 1,6 chồi/mẫu [167]. Tóm lại, trên cả 3 giống và 2 qui cách mẫu, sử dụng BA ở nồng độ 2 mg/l cho kết quả tái sinh chồi tốt nhất. Do đó nồng độ này sẽ đƣợc sử dụng cho các thí nghiệm chuyển gen ở giai đoạn nuôi chung và tái sinh chọn lọc chồi chuyển gen.
3.4. Ảnh hƣởng của IBA lên sự tạo rễ của chồi in vitro
Các cụm chồi hình thành trên mơi trƣờng tái sinh bổ sung 2 mg/l BA đƣợc chuyển sang môi trƣờng tăng trƣởng thân SE. Chồi của 3 giống phát triển tốt trên môi trƣờng SE, cao khoảng 3 cm sau 2 tuần. Các chồi này sau đó đƣợc tách riêng, cấy lên môi trƣờng tạo rễ.
Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi đậu tƣơng
in vitro của các giống MTĐ 176, HL 07-15 và OMĐN 29 đƣợc trình bày trong bảng
3.7. Ở các nghiệm thức đối chứng khơng bổ sung IBA, có sự tạo rễ từ chồi ở cả ba giống MTĐ 176 (53,33%), HL 07-15 (46,67%) và OMĐN 29 (43,33%). Tuy nhiên, số rễ
tạo rễ của chồi tăng dần cả về tỉ lệ chồi tạo rễ và số chồi/rễ, đạt tối ƣu với 1 mg/l IBA ở hai giống MTĐ 176 (93,33%; 3,93) và HL07-15 (90,00%; 3,67). Tăng nồng độ IBA lên 1,5-2 mg/l dẫn đến chồi của hai giống MTĐ 176 và HL 07-15 giảm khả năng tạo rễ, rễ tạo thành ngắn hơn. Đối với giống OMĐN 29, khả năng tạo rễ đạt tối ƣu ở 1,5 mg/l IBA, tăng nồng độ lên 2 mg/l mức độ tạo rễ cũng giảm và có sự hình thành mơ sẹo (hình 3.8).
Hình 3.8. Sự tạo rễ của chồi in vitro của các giống MTĐ 176, HL 07-15
và OMĐN 29 ở các nồng độ IBA khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy.
a, b, c, d, e. sự tạo rễ của chồi MTĐ 176 ở các nồng độ I A tương ứng: 0; 0,5; 1; 1,5; 2 mg/l. f, g. sự tạo rễ của chồi HL 07-15 ở các nồng độ IBA: 0; 1 mg/l. h, i. sự tạo rễ của chồi OMĐN 29 ở các nồng độ IBA: 0; 1,5 mg/l
Nhƣ vậy, ở cả ba giống MTĐ 176, HL 07-15 và OMĐN 29, IBA đều có tác động rõ rệt làm tăng khả năng tạo rễ của chồi in vitro. Nồng độ IBA tối ƣu cho sự cảm ứng tạo rễ của giống MTĐ 176 và HL 07-15 là 1 mg/l, với giống OMĐN 29 là 1,5 mg/l. Khi nồng độ IBA cao ngƣợc lại làm giảm khả năng tạo rễ, đồng thời có sự cảm ứng tạo nhiều mô sẹo. Nhiều nghiên cứu trên các giống đậu tƣơng trong và ngoài nƣớc cũng ghi nhận khả năng cảm ứng tạo rễ tốt của IBA đối với chồi đậu tƣơng in vitro, nồng độ tối ƣu của IBA khoảng 1 mg/l. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hƣờng và cộng sự (2009) trên 2 giống ĐT12 và ĐT84 cho thấy 1 mg/l IBA cảm ứng tạo rễ tốt nhất với tỉ lệ chồi tạo rễ ĐT12 (98%) và ĐT84 (97%), khi tăng nồng độ IBA lên 1,5-2 mg/l đều làm giảm hiệu quả tạo rễ [107]. Zia và cộng sự
(2010) cũng nhận thấy 1 mg/l IBA giúp cảm ứng tạo rễ tốt nhất trên cả giống NARC-4 (76,3% chồi tạo rễ; 4,7 rễ/chồi) và NARC-7 (55,3% chồi tạo rễ; 2,2 rễ/chồi), tăng nồng độ IBA dẫn đến giảm khả năng tạo rễ [103].
ảng 3.7. Ảnh hƣởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi đậu tƣơng in vitro
IBA (mg/l) Tỷ lệ chồi tạo rễ (%)
1 Số rễ trung bình/chồi2 MTĐ 176 HL 07-15 OMĐN 29 MTĐ 176 HL 07-15 OMĐN 29 0,0 53,33 d 46,67 c 43,33 e 0,67 ± 0,12 d 0,53 ± 0,15 e 0,50 ± 0,10 e 0,5 70,00 bc 63,33 b 56,67 d 2,03 ± 0,35 bc 1,43 ± 0,15 d 1,23 ± 0,21 d 1,0 93,33 a 90,00 a 73,33 c 3,93 ± 0,51 a 3,67 ± 0,40 a 2,20 ± 0,36 c 1,5 76,67 b 83,33 a 96,67 a 2,57 ± 0,35 b 2,70 ± 0,36 b 4,23 ± 0,40 a 2,0 56,67 cd 66,67 b 86,67 b 1,57 ± 0,25 c 1,90 ± 0,26 c 2,83 ± 0,25 b
Các chữ cái khác nhau (a, b, c…) trên cùng một cột biểu diễn sự khác biệt có ý nghĩa với P ≤ 0,05 theo kiểm định thống kê LSD. Số liệu (1) đã được chuyển đổi sang dạng arcsin√x; số liệu (2) được chuyển sang dạng log(x+1) trước khi xử lý thống kê.
Nội dung 2: Khảo sát các điều kiện thích hợp để ứng dụng trong qui trình chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng
3.5. Ảnh hƣởng của PPT lên khả năng tái sinh của đốt lá mầm và một nửa hạt
Đốt lá mầm của 3 giống đậu tƣơng HL 07-15, OMĐN 29 và MTĐ 176 đƣợc tái sinh trên môi trƣờng SI bổ sung chất chọn lọc PPT ở các nồng độ khác nhau để xác định mức độ ảnh hƣởng lên khả năng tạo chồi của mẫu, từ đó chọn đƣợc nồng độ PPT thích hợp cho việc chọn lọc chồi chuyển gen. Sử dụng chất chọn lọc thích hợp là một trong những yếu tố quan trọng, góp phần quyết định tỉ lệ cây chuyển gen nhận đƣợc. Kết quả mức ảnh hƣởng đƣợc ghi nhận ở bảng 3.8, hình 3.9.
Nhìn chung, các kết quả ghi nhận đƣợc cho thấy các giống khảo sát đều có đáp ứng khá nhạy cảm với PPT ở mức độ tƣơng tự nhau trong sự hình thành chồi của đốt lá mầm. Ở nghiệm thức đối chứng không bổ sung PPT, hầu hết mẫu đốt lá mầm tạo nhiều chồi, các chồi phát triển tốt. Khi bổ sung PPT vào môi trƣờng ở nồng độ thấp 1; 2 mg/l đã cho thấy mức độ tác động nhẹ, làm giảm khả năng tạo chồi nhƣng không đáng kể. Các chồi hình thành vẫn có thể tiếp tục phát triển. Tăng nồng độ PPT lên 3; 4 mg/l đã ảnh hƣởng rõ rệt, làm giảm đáng kể tỉ lệ mẫu tạo chồi
và số chồi/mẫu, chồi kém phát triển. Ở nồng độ 5 mg/l tất cả các mẫu của giống HL 07-15, OMĐN 29 đều khơng có khả năng tạo chồi, chỉ một số ít mẫu giống MTĐ 176 có sự hình thành chồi trong thời gian ngắn, sau đó chết dần.
ảng 3.8. Ảnh hƣởng PPT lên sự tái sinh chồi của đốt lá mầm.
Nồng độ PPT (mg/l)
Tỉ lệ đốt lá mầm tái sinh chồi (%)1
MTĐ 176 HL 07-15 OMĐN 29 0 90,00 a 93,33 a 93,33 a 1 73,33 b 66,67 b 73,33 b 2 56,67 c 46,67 c 66,67 c 3 43,33 d 33,33 d 46,67 d 4 26,67 e 13,33 e 26,67 e 5 13,33 f 0,00 f 0,00 f 6 0,00 g 0,00 f 0,00 f 7 0,00 g 0,00 f 0,00 f 8 0,00 g 0,00 f 0,00 f
Các chữ cái khác nhau (a, b, c…) trên cùng một cột biểu diễn sự khác biệt có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong phép thử Duncan. Số liệu (1) đã được chuyển đổi sang dạng arcsin√x trước khi xử lý thống kê.
Với các nồng độ 6; 7; 8 mg/l, tất cả các mẫu đều khơng cịn khả năng tạo chồi, vùng đốt lá mầm bị nâu đen và chết dần. Nhƣ vậy 5 mg/l PPT đối với giống HL 07-15, OMĐN 29 và 6 mg/l PPT đối với giống MTĐ 176 là nồng độ thấp nhất có thể ức chế hồn tồn khả năng tạo chồi của đốt lá mầm, do đó là nồng độ sẽ đƣợc sử dụng để chọn lọc thể chuyển gen. Chất chọn lọc PPT đƣợc sử dụng ở ngƣỡng ức chế tái sinh trong quá trình chọn lọc thể chuyển gen nhằm hạn chế việc tạo mẫu khảm, "escape" (không chuyển gen nhƣng qua đƣợc bƣớc chọn lọc). Các kết quả ảnh hƣởng của PPT lên đốt lá mầm đƣợc áp dụng cho mẫu một nửa hạt do