2.1 Vật liệu
2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu là mẫu ADN HPV từ dịch phết âm đạo của nữ giới ở độ tuổi 18 đến 45 ở Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh trong năm 2014. Các chủng HPV có nguy cơ cao (hrHPV) được phát hiện bởi bộ sinh phẩm Cobas 4800 (Roche, Đức). Đồng thời các mẫu kể trên được xác định chủng tại Viện Ung Thư- CHLB Đức và giải trình tự được một số gen E6, E7, L1. Bộ mẫu này được sử dụng như mẫu chuẩn của nghiên cứu.
Ở mục tiêu 1, chúng tôi sử dụng số lượng mẫu n <5 cho mỗi chủng HPV đang nghiên cứu để xây dựng phương pháp. Các trình tự genome HPV tìm thấy ở ngân hàng gen NCBI (từ khóa: human papillomavirus complete genome) được tải
về, tạo cơ sở cho việc thiết kế primer và probe.
Ở mục tiêu 2, chúng tôi sử dụng số lượng mẫu lớn hơn, đa dạng về genotype (n= 2-20) để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp.
2.1.2 Sinh phẩm và vật tƣ tiêu hao
Sinh phẩm sử dụng trong nghiên cứu sử dụng trong nghiên cứu, bao gồm: - Sinh phẩm cho phản ứng Realtime PCR: các cặp primer và probe đặc hiệu với một số đoạn gen đặc trưng cho các chủng HPV nguy cơ cao(IDT, Mỹ); Quantifast Multiplex PCR Kit (QiaGen, CHLB Đức).
- Sinh phẩm cho tạo dòng và sản xuất chứng dương:
+ Sinh phẩm cho phản ứng PCR khuếch đại các gene 16E6-E7, 18L1, 52L1: các cặp primer tương ứng, H2O, DreamTaq buffer 10X, Enxyme DreamTaq, MgCl2, dNTPs và sinh phẩm cho điện di gồm agarose, Redsafe, TAE 1X.
+ Sinh phẩm cho nhân dòng: Kit tinh sạch ADN qua gel của Promega, môi trường nuôi cấy LB lỏng, môi trường nuôi cấy LB đặc, vector P-entry D.Topo, tế bào khả biến E. Coli TOP10, Kanamycine.
Các vật tư tiêu hao sử dụng trong nghiên cứu gồm: eppendoft 0.2ml, 0.5ml, 1.5ml (Bio Sorenson, Mỹ) , falcol, tip, đĩa nuôi cấy v.v...
2.1.3 Máy móc và thiết bị
Thiết bị của phịng thí nghiệm Miễn dịch Vắc Xin, Khoa Miễn Dịch và Sinh học phân tử, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương được sử dụng trong từng mục tiêu nghiên cứu như sau:
Mục tiêu 1
- Máy Realtime PCR Rotogen-Q (QiaGen, CHLB Đức) Mục tiêu 2
- Máy PCR Mastercycler epgradient S của Eppendoft (CHLB Đức), nguồn điện di (Biorad, Mỹ), bể điện di (Sigma, Mỹ), máy chụp ảnh gel (Biorad, Mỹ)
- Tủ ấm nuôi cấy vi khuẩn (NUAIRE, ), máy lắc, bể ổn nhiệt - Máy đo OD Nanodrop
Ngồi ra cịn các thiết bị khác: tủ hood an toàn sinh học để trộn phản ứng PCR và tra mẫu, cân phân tích, máy vortex, máy minispin, máy li tâm, lị vi sóng, tủ lạnh -20ºC, tủ lạnh 4ºC v.v…
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1Xây dựng kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV 16, 18,33/52
2.2.1.1 Thiết kế primer và probe cho phản ứng Realtime PCR
Trình tự primer được tham khảo từ các bài báo trên cơ sở dữ liệu Pubmed (NCBI). Các phần mềm tin sinh được sử dụng:
+ Primer 5: Kiểm tra các đặc điểm của primer và probe: chiều dài, %GC, cấu trúc hairpin, sự bắt cặp không đặc hiệu giữa hai primer hoặc giữa primer và trình tự đích; chiều dài sản phẩm, tính đặc hiệu của primer và probe với trình tự đích trên ADN HPV.
+ Mega 5: Kiểm tra tính đặc hiệu của primer và probe với nhiều trình tự genome khác nhau của chủng HPV đang cần phát hiện và các chủng HPV cịn lại. Các trình tự này được thảm khảo từ cơ sở dữ liệu Nucleotide (NCBI). Kiểm tra tính đặc hiệu của primer và probe với các trình tự E6, E7 và L1 của các chủng HPV16, 18 và 52 mà nhóm nghiên cứu đã phân tích được để xác định tính đặc hiệu của primer và probe với các chủng HPV đang lưu hành ở Việt Nam.
Từ dữ liệu tham khảo trong các bài báo[28, 33-34], trình tự genome của các chủng HPV trên cơ sở dữ liệu, trình tự các đoạn gen mà nhóm nghiên cứu phân tích đượcvà các phần mềm tin sinh kiểm tra,chúng tôi thiết kế được primer và probe cho
nhận biết HPV16 cho kết quả dương tính trên kênh HEXvà phát hiện đoạn trình tự đặc hiệu ở vùng HPV16 E6-E7 [34]; primer và probe nhận biết HPV18 cho kết quả dương tính trên kênh Cy5 và phát hiện đoạn trình tự đặc hiệu ở gen HPV18 L1 [33]; primer và probe nhận biết HPV33/52 cho kết quả dương tính trên kênh FAM và phát hiện đoạn trình tự đặc hiệu ở gen HPV33/52 L1 [28]; primer và probe chứng nội kiểm (IC) cho kết quả dương tính trên kênh Cy5.5 và phát hiện đoạn trình tự đặc hiệu trên gen HMBS (Hydroxymethylbilane synthase) – là một gen quản gia nằm trên nhiễm sắc thể số 11 trong hệ genome người, mã hóa cho enzyme Hydroxymethylbilane synthase, enzyme này tham gia vào quá trình sinh tổng hơp protein Hem, thành phần có trong máu, tủy xương và gan. Cả 4 trình tự mồi sử dụng trong kỹ thuật realtime PCR đều khuếch đại sản phẩm có kích thước không quá 200bp.
2.2.1.2 Xác định tính đặc hiệu của primer và probe trong phản ứng Realtime PCR
Xác định tính đặc hiệu của primer và probe bao gồm hai bước sau:
(1)Thực hiện phản ứng realtime đơn cặp primer và probe: từng cặp primer và probe riêng lẻ.
(2) Thực hiện phản ứng realtime đa cặp primer và probe: trộn 4 cặp primer và probe.
Phản ứng Realtime PCR thực hiện trên máy Rotogen Q (Qiagen, CHLB Đức) với các thành phần phản ứng như sau: primer xuôi, primer ngược, probe tương ứng với từng cặp primer, QuantiFast Multiplex 2X Mastermix (Qiagen, CHLB Đức).
Sau khi thực hiện phản ứng realtimeđơn cặp primer và probe với các điều kiện khác nhau: nồng độ primer và probe, thay đổi một số loại enzyme khác nhau, chúng tôi đưa ra thành phần và nồng độ tương ứng của phản ứng Realtime PCR đơn cặp primer và probe ởbảng 2.1, thành phần và nồng độ tương ứng của phản ứng Realtime PCR đa cặp primer và probe ở Bảng 2.2.
Chu trình nhiệt của phản ứng như sau: 95oC trong 10 phút; 45 chu kì (95oC trong 15 giây, 60oC trong 60 giây). Huỳnh quang phát ra ở giai đoạn nhiệt 60oC trong 60 giây được ghi nhận ở một trong các kênh HEX (HPV16)/Cy5 (HPV18)/ FAM (HPV33/52) tương ứng với từng tác nhân cần nhận biết của kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe đối với kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer; ghi nhận ở cả 4 kênh HEX (HPV16)/Cy5 (HPV18)/ FAM (HPV33/52)/ Cy5.5 (IC) với kỹ thuật realtime PCR đa cặp primer và probe.
Bảng 2.1. Thành phần kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe STT Thành phần V(µl)/1 phản ứng Nồng độ cuối cùng STT Thành phần V(µl)/1 phản ứng Nồng độ cuối cùng 1 H2O 3.15 µl - 2 Quantifast 2X mastermix 7.5 µl 1X 3 Primer forward 0.6 µl 400nM 4 Primerreverse 0.6 µl 400nM 5 Probe 0.15 µl 100nM 6 ADN HPV 3 µl - Tổng 15 µl -
Bảng 2.2. Thành phần kỹ thuật realtime PCR đa cặp primer và probe
STT Thành phần V(µl)/1 phản ứng Nồng độ cuối cùng 1 H2O 1.5 - 2 Quantifast 2X mastermix 7.5 1X 3 Cặp primer HPV16 0.6 400nM 4 Cặp primer HPV18 0.6 400nM 5 Cặp primer HPV33/52 0.6 400nM 6 Cặp primer HPV IC 0.6 400nM 7 Probe HPV16 0.15 100nM 8 Probe HPV18 0.15 100nM 9 Probe HPV33/52 0.15 100nM 10 Probe IC 0.15 100nM 11 ADN HPV 3 Tổng 15 -
2.2.2 Tạo chứng dƣơng và xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52
Chứng dương của kỹ thuật realtime PCR là hỗn hợp của 3 plasmid mang các đoạn chèn của trình tự đích do đó ln được nhận biết khi có mặt trong phản ứng realtime PCR. Sản xuất chứng dương bằng cách tạo ra các plasmid mang đoạn chèn là trình tự đích. Giới hạn phát hiện của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52 được xác định bằng số bản copi tối thiểucủa chứng dươngtrong một phản ứng mà kỹ thuật realtime PCR vẫn phát hiện được.
2.2.2.1 Khuếch đại trình tự gen đích của phản ứngRealtimePCR
Trình tự gen đích gồm HPV16E6-E7, HPV18 L1 và HPV52 L1. Do cặp primervà probe phát hiện HPV33/52 phát hiện đoạn trình tự đặc hiệu giống nhau trên cả 2 chủng HPV33 và 52 nên sử dụng trình tự HPV52L1 để tạo chứng dương cho tác nhân HPV33/52.
Thiết kế primer khuếch đại các trình tự đích
Trình tự primer dùng để khuếch đại gen E6-E7 của chủng HPV 16 được tham khảo từbài báo[24] trên cơ sở dữ liệu Pubmed (NCBI). Trình tự gen L1 của các chủng HPV18, HPV52 ngoài việc sử dụng cho nghiên cứu chính này cịn được sử dụng cho những nghiên cứu chuyên sâu hơn, nên nhóm nghiên cứu tham khảo các trình tự gen L1 của các chủng HPV18, 52 trên cơ sở dữ liệu Nucleotide (NCBI) và tự thiết kế cặp primer khuếch đại gen L1 của các chủng HPV18 và HPV52. Sử dụng các phần mềm tin sinh Mega5, Primer5 đánh giá lại cặp primer được lựa chọn. Thiết kế được 3 cặp primer để khuếch đại trình tự đích của phản ứng Realtime PCR HPV16 E6-E7, HPV18 L1 và HPV52 L1cho các đoạn sản phẩm có kích thước tương ứnglà 876bp, 1720bp và 1606bp.
Phản ứng PCR khuếch đại các trình tự đích
Phản ứng PCR được sử dụng để khuếch đại các trình tự gen E6-E7 của HPV16 và L1của HPV18, 52. Tiến hành tối ưu hóa các điều kiện phản ứng cho từng cặp primer: nồng độ primer, dNTP, MgCl2, nồng độ và loại enzyme (Dream Taq, green 2X Master mix, Fedili Taq), nhiệt độ gắn primer. Các thành phần, nồng độ tương ứng và chu kì nhiệt của phản ứng PCR đươ ̣c trình bày ở Bảng 2.3 và Bảng 2.4.Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1.5%.
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng khuếch đại trình tự đích
STT Thành phần 25µl/1pư Nồng độ cuối cùng
1 H2O-DEPC 14.4 µl -
2 Dream Taq Buffer 10X 2.5 µl 1X
3 Primer forward (10 µM) 0.5 µl 200nM 4 Primer reverse (10 µM) 0.5 µl 200nM
5 dNTP (10mM) 1.0 µl 0.4mM
6 MgCl2 (25mM) 1.0 µl 1mM
7 Enzyme Dream Taq 0.1 µl 20U/ml
8 AND HPV 5 µl -
9 Tổng 20 µl -
Bảng 2.4. Chu kì nhiệt của phản ứng khuếch đại trình tự đích
Trình tự HPV16E7E6-E7 HPV18L1 HPV52L1 94ºC – 3p 40 chu kỳ 94ºC – 30s 48ºC – 30s 72ºC – 1p 94ºC – 30s 42ºC – 30s 72ºC – 2p 94ºC – 30s 50ºC – 30s 72ºC – 2p 72ºC– 10p 4ºC – ∞
Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự
Sản phẩm PCR sau khi kiểm tra bằng điện di cho kết quả dương tính với các băng có kích thước mong muốnđược tinh sạch bằng Kit tinh sạch ADN Promega.
Đo OD sản phẩm sau tinh sạch và tiến hành phaloãng để mẫu đạt nồng độ 50 ng/ul và gửi đi giải trình tự ở cơng ty Macrogen (Hàn Quốc). Kết quả giải trình tự được phân tích bằng phần mềm Bioedit và Mega5 để chọn lọc ra các trình tự tiêu biểu để tiến hành nhân dòng.
2.2.2.2 Sản xuất chứng dƣơngvà xác định giới hạn phát hiện củakỹ thuật realtime PCR
Nhân dịng trình tự đích tạo chứng dương
Sản phẩm PCR HPV16E6-E7, HPV18L1, HPV52L1 sau khi tinh sạch và giải trình tự sẽ được chọn lọc tiến hành chèn gen vào trong vector Pentr D.Topo (với HPV18L1 và HPV52L1) và vector pGEM T easy (với HPV16E6-E7), biến nạp vào tế bào khả biến E. Coli TOP10, sau đó ni cấy trên mơi trường LB đặc có bổ sung Kanamycine 50mg/l, rồi tiến hành chọn khuẩn lạc sau 18 tiếng.
Kiểm tra kết quả nhân dịng gen bằng phản ứng PCR các khuẩn lạc ni cấy với cặp primer của vector pGEM-T hoặc cặp primer khuếch đại đoạn chèn (trình tự đích). Đồng thời cấy vạch các khuẩn lạc được chọn để PCR sang đĩa nuôi cấy khác.
Nuôi khuẩn lạc mang đoạn chèn của HPV trong falcol 15ml chứa môi trường LB lỏng có bổ sung Kanamycine 50mg/ml trong 16-18h. Sau đó tinh sạch plasmidtừ dịch nuôi cấy bằng kit tinh sạch Plasmid của Promega. Plasmid sau tinh sạch được điện di kiểm tra và kiểm tra lại bằng phản ứng PCR với cặp primer vector.
Plasmid mang đoạn chèn HPV16E6-E7, HPV18L1 và HPV52L1 sau tinh sạch được sử dụng để tạochứng dương của phản ứng Realtime PCR.
Xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật realtime PCR
Plasmid mang đoạn chèn HPV16E6-E7, HPV18L1 và HPV52L1sau khi tinh sạch được tiến hành đo OD để xác định nồng độ, từ đó tính được số bản copy của plasmid theo công thức sau [44]:
A = (X*6.0221*1023) / (N*660*109) Trong đó A: số bản copy của plasmid trong 1 đơn vị thể tích X: khối lượng của plasmid trong đơn vị thể tích cần tính
N: chiều dài của plasmid mang đoạn chèn
Tiến hành pha loãng plasmid để tạo chứng dương là hỗn hợp 3 plasmid với dải nồng độ từ 1010 copy/ul đến 100 copy/ul. Xác định giới hạn phát hiện của phản ứng multiplex Realtime PCR ở các nồng độ chứng dương sau 105, 103,102, 101,100 copy/ul. Từ đó xác định được số bản copy tối thiểu của chứng dương trong mỗi phản ứng mà kỹ thuậtmultiplex realtime PCR phát hiện được.
Tối ưu hóa kỹ thuật realtime PCR phát hiện đa tác nhân trên chứng dương vừa sản xuất và dùng kỹ thuật realtime PCR đã được tối ưu hóa để đánh giá các chỉ tiêu của việc thẩm định phương pháp Realtime PCR.
2.2.3 Thẩm định phƣơng pháp phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52
Thẩm định phương pháp là việc khẳng định bằng kiểm tra và cung cấp bằng chứng khách quan để chứng minh các yêu cầu cụ thể đối với mỗi mục đích sử dụng đặc thù đã được đáp ứng đầy đủ (ISO/IEC 17025: 2005).Thẩm định kỹ thuật Realtime PCR được xây dụng bên trên là xác định khả năng phát hiện của kỹ thuật realtime PCR đối với tác nhân HPV16, 18 và 33/52 thông qua việc đánh giá các chỉ tiêu sau: độ chính xác, độ chụm, độ đặc hiệu, độ nhạy[35].
Độ chính xác: Độ chính xác thể hiện mức độ thống nhất của kết quả phân
tích với giá trị thực của chúng. Sự chênh lệch giữa giá trị phân tích và giá trị thực càng nhỏ thìđộ chính xác càng cao. Thực hiện phản ứng Realtime trên 6 mẫu dương tính (với một trong bốn chủng HPV 16, 18, 33, 52) và 3 mẫu âm tính (với các chủng HPV 16, 18, 33 và 52) thuộc bộ mẫu chuẩn của nghiên cứu
Độ chụm: Mức độ thống nhất của các kết quả xét nghiệm riêng lẻ trong một
lần thực hiện thí nghiệm và giữa các lần thực hiện khác nhau, được xác định thông qua hệ số lặp lại và hệ số tái lập.
- Hệ số lặp lại (độ chụm trong 1 lần thử nghiệm): thực hiệnphản ứng Realtime trên 2 mẫu dương tính, mỗi mẫu được lặp lại 3 lần trong 1 lần thử nghiệm.
- Hệ số tái lập (độ chụm giữa các lần thử nghiệm): thực hiện phản ứng Realtime trên 3 mẫu dương tính, tiến hành 3 lần thử nghiệmriêng biệt bởi 3 kỹ thuật viên khác nhauvới mỗi mẫu.
Độ đặc hiệu: Tỷ lệ kết quả thật sự âm tính trong tổng số kết quả âm tính của
thử nghiệm. Xác định bằng tỷ lệkết quả âm tính khi thực hiện phương pháp mớivới20 mẫu âm tínhcủa bộ mẫu chuẩn,
Độ nhạy:Tỷ lệ kết quả thật sự dương tính trong tổng số kết quả dương tính
2.3 Nội dung thực hiện
(*)
Mỗi mẫu thực hiện 3 lần trong 1 lần thử nghiệm
(**)
Mỗi mẫu thực hiện 3 lần thử nghiệm riêng biệt bởi các kỹ thuật viên khác nhau Mục tiêu 1
Xây dựng phương pháp
Mục tiêu 2
Thẩm định phương pháp
Thiết kế primer và probe phát hiện chủng HPV16, 18, 33/52
Tạo chứng dương + Khuếch đại trình tự đích + Nhân dịng trình tự đích
Đánh giá tính đặc hiệu primer và probe:
+ Phản ứng realtime PCR đơn cặp primer và probe (n<5)
+ Phản ứng realtime PCR đơn cặp
primer và probe (n<5) Thẩm định phương pháp Độ chính xác: 6 mẫu dương, 3 mẫu âm
Độ chụm:
+Độ lặp lại: 2 mẫu dương (*)
+Độ tái lập: 2 mẫu dương (**) Độ đặc hiệu: 20 mẫu âm Độ nhạy: 20 mẫu dương Tính số copy tối
thiểu của chứng dương mà kỹ thuật realtime PCR xác định được
CHƢƠNG3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Xây dựng kỹ thuậtRealtime PCR phát hiện các chủng HPV 16,18 và 33/52
Sau khi chọn được các cặp primer và probe, tối ưu được các điều kiện cho kỹ thuật realtime PCR, thực hiện kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe đặc hiệu cho từng chủng HPV và kỹ thuật realtime PCR với 4 cặp primer và probe để phát hiện các chủng HPV16, HPV18, HPV52 và 33, kết quả thu được như sau.
3.1.1 Kỹ thuậtRealtime PCR đơn cặp primer và probe
Thực hiện kỹ thuậtRealtime PCR đơn cặp primer, probe với các chủng HPV hiện có trong bộ mẫu chuẩn để đánh giá tính đặc hiệu của các cặp primer và probe được thiết kế.
3.1.1.1 Kỹ thuật Realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV16
Cặp primer và probe phát hiện HPV16 cho tín hiệu huỳnh quang thu nhận ở kênh HEX. Kết quả của phản ứng Realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV16 phân tích trên kênh HEX được trình bày ở Bảng 3.1 và Hình 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV16
STT Tên mẫu Genotype
Kết quả/giá trị Ct
Theo kit thương mại * Theo phương pháp nghiên cứu 1 A248 HPV16 Dương tính/27,3 Dương tính/26,2