CHƢƠNG 2 : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Hóa chất sinh phẩn
- Hóa chất dùng cho tách bạch cầu, tách RNA - Hóa chất dùng cho tổng hợp cDNA
- Hóa chất dùng cho phản ứng RT-PCR - Hóa chất dùng cho điện di trên gel agarose
2.2.2. Trang thiết bị, máy móc
- Máy PCR - Bộ điện di
- Máy ly tâm eppendorf - Máy lắc ổn nhiệt - Hệ thống chụp ảnh gel
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu
Mơ tả cắt ngang có phân tích
2.3.2. Cách chọn mẫu
Chọn mẫu thuận tiện cho đến khi kết thúc nghiên cứu.
Các mẫu mang đột biến gen FLT3 - TKD và NPM1-mutA và chứng dương
(POS) đã được khẳng định.
2.3.3. Sơ đồ nghiên cứu
Hình 9. Sơ đồ nghiên cứu
Dƣơng tính, đúng kích thƣớc
Đọc trình tự, đối chiếu với gen chuẩn (ref.seq.) hoặc
đối chiếu mới POS
Âm tính hoặc khơng đúng kích thƣớc Mẫu dịch hút tủy xƣơng
RNA tổng số
Quy trình RT-PCR
Sản phẩm PCR
Áp dụng quy trình để phân tích mẫu
2.3.4. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
Thực hiện theo quy trình tại khoa Di truyền - Sinh học phân tử viện Huyết học - Truyền máu Trung Ương.
2.3.4.1. Kỹ thuật tách bạch cầu từ máu ngoại vi hoặc dịch tủy xương bằng dung dịch ERL (Omega)
Để ống máu tự lắng hoặc ly tâm 3000 vòng /phút trong 1 phút. Chuẩn bị ống eppendoft 1,5 ml, ghi tên hoặc mã số người bệnh. Hút phần giàu bạch cầu (buffy coat) nằm giữa lớp huyết tương và tế bào máu. Bổ xung dung dịch ERL cho đủ thể tích 1,5 ml, lắc ống mạnh trong 10 giây. Ủ mẫu 10 phút trong tủ -20oC. Ly tâm 1700 vòng/phút trong 5 phút, hút bỏ dịch, giữ lại cặn tế bào. Bổ sung ERL buffer cho đủ 1,5ml, búng cho tan cặn tế bào. Ly tâm 1700 vòng/phút trong 5 phút, hút bỏ dịch, giữ lại cặn tế bào. Bổ sung 500 µl dung dịch NTL lysis buffer, dùng bơm tiêm trộn đều đến khi dung dịch đồng nhất.
2.3.4.2. Kỹ thuật tách RNA sử dụng kít OMEGA *Với hộp kit mới:
Thêm 450 ml DEPC Water vào chai ERL Buffer. Thêm 200 ml Ethanol (100%) vào chai RNA Wash Buffer II. Thêm 60 µl 2-mercaptoethanol vào 30 ml NTL Lysis Buffer (2-mercaptoethanol: NTL Lysis Buffer = 20 µl : 1 ml) – hỗn hợp bảo quản 2 tuần ở nhiệt độ phòng
*Trước khi bắt đầu:
Chẩn bị khay đá, máy ly tâm 40C, ủ DEPC (1.5 ml) ở 650C.
* Tiến hành:
Rã đông bạch cầu đã lysis trong NTL Lysis Buffer. Chèn cột Homogenizer Column vào ống 1,5 ml, ghi mã người bệnh trên nắp cột và ống 1,5 ml. Chuyển dịch sang cột Homogenizer Column. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút. Giữ lại dịch qua cột, loại bỏ cột. Thêm 500 µl cồn 70%, trộn đều (Nếu có tủa tạo thành sẽ
làm giảm hiệu suất thu RNA). Chèn cột Hibind RNA Mini Column vào ống 2 ml, ghi mã người bệnh. Chuyển 500 µl dịch lên cột Hibind RNA Mini Column. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút. Loại bỏ dịch qua cột. Chuyển hết dịch còn lại lên cột. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút. Loại bỏ dịch qua cột. Thêm 600 µl RWF Wash Buffer. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút. Chuyển cột sang ống 2 ml mới. Thêm 500 µl RNA Wash Buffer II. Ly tâm 13000 vịng/phút trong 2 phút. Loại bỏ dịch qua cột. Lặp lại bước rửa một lần nữa. Chuyển cột sang ống 2 ml mới, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút. Chuyển cột sang ống 1,5 ml. Bổ sung 50 µl dung dịch DEPC vào chính giữa màng lọc. Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 13,000 vòng/phút trong 2 phút. RNA thu được bảo quản ở -700C.
2.3.4.3. Định lượng RNA tổng số trên máy đo quang phổ nanodrop
RNA được định lượng trên máy Nanodrop. Nguyên lý của phương pháp là dựa vào độ hấp phụ ánh sáng của các bazơ nitơ ở bước sóng 260nm (A260).
Phương pháp này đánh giá nồng độ và độ tinh sạch RNA. Độ hấp thụ ánh sáng của mẫu RNA pha lỗng được đo ở bước sóng 260 và 280 nm. Sử dụng định luật Beer-Lambert để tính tốn mật độ RNA:
A = Ecl
Trong đó: A= độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng nhất định, C = nồng độ nucleid acid. l = chiều dài đường truyền của ánh sáng qua mẫu hay độ dày cuvet (thường là 1 mm). E = hệ số háp thụ (đối với RNA E= 0,025 (mg/ml)-1cm-1)
Trị số A260 1.0 tương đương ~ 40 µg/mL RNA sợi đơn. Tỷ số A260/A280 dùng để đánh giá độ tinh sạch của RNA. A260/A280 ~ 1,8 – 2,1 cho thấy RNA đã tinh sạch.
Tất cả các mẫu RNA được pha lỗng về nồng độ 100 ng/µl bằng dung dịch elution buffer.
2.3.4.4. Tổng hợp cDNA bằng kit JENA Bảng 4. Thể tích các thành phần tổng hợp cDNA STT Sinh phẩm Thành phần/1 phản ứng (µl) 1 H2O 2,0 2 SCRIPT RT buffer 4,0 3 dNTP mix 1,0 4 DTT stock 1,0 5 Rnase inhibitor 1,0 6 Primer (oligo T) 0,5 7 SCRIPT reverse transcriptast 0,5 8 RNA 10µl (1µg) 9 Tổng thể tích 20 µl
Chu trình nhiệt: |420C 10’ 500C 60’ 700C 10’ | 40C forever
2.3.4.5. Khuếch đại đoạn gen chứa đột biến bằng cặp mồi đặc hiệu bằng phản ứng RT - PCR
Trình tự mồi và thành phần phản ứng của đột biến gen FLT3 - ITD và TKD được tham khảo theo cơng trình nghiên cứu Hitoshi Kiyoi và Tomoki Naoe đăng trên tạp chí Leukemia năm 1999, tiêu đề: “FLT3 Mutations in Acute Myeloid Leukemia” [36].
Trình tự mồi của đột biến gen NPM1-mutA được tham khảo theo cơng trình
nghiên cứu của Tiziana Ottone và cộng sự năm 2008, tiêu đề “An Allele-Specific RT-PCR Assay to Detect Type A Mutation of the Nucleophosmin-1 Gene in Acute Myeloid Leukemia” [55].
cDNA được sử dụng làm khuôn trong phản ứng RT - PCR với các cặp mồi tương ứng:
a. Đột biến gen FLT3 - ITD Trình tự mồi:
11F: 5ʹ -GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC- 3ʹ 12R: 5ʹ -CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC-3ʹ
Thành phần phản ứng:
Bảng 5. Thành phần và thể tích master mix của phản ứng RT - PCR nhân đoạn gen FLT3-ITD
STT Sinh phẩm Thành phần/1 phản ứng (µl) 1 H2O 15,0 2 10X PCR Buffer 2,5 3 dNTPs 2.5 mM 2,0 4 MgCl2 25 mM 2,0 5 FLT3-11F 50 pM 1,0 6 FLT3-12R 50 pM 1,0
7 Ampli Taq Gold 0,5
8 mẫu 1,0
Tổng thể tích 25,0
Chu trình nhiệt: 950C 4' |940C 30" 560C 45" 720C 30"|x35 720C 10' 150C forever
Điện di: [12 µl/lane] [Gel agarose 3% -- chạy 100V 30’ – 60’] b. Đột biến gen FLT3 - TKD
Trình tự mồi:
17F: 5` -CCGCCAGGAACGTGCTTG- 3` 17R: 5` -GCAGCCTCACATTGCCCC- 3` Thành phần phản ứng:
Bảng 6. Thành phần và thể tích master mix của phản ứng RT - PCR nhân đoạn gen FLT3-TKD và cắt sản phẩm PCR với EcoRV
STT Sinh phẩm Thành phần/1 phản ứng (µl) 1 H2O 8,5 2 Taq PCR MM 2X 12,5 3 FLT3-17F 10 pM 1,0 4 FLT3-17R 10 pM 1,0 5 Sản phẩm cDNA 2,0 Tổng thể tích 25,0 Chu trình nhiệt: 950C 4' |950C 30" 640C 45" 720C 30”|x40 720C 1' 150C forever Cắt sản phẩm PCR với EcoRV STT Sinh phẩm Thành phần/1 phản ứng (µl) 1 H2O 14,0 2 10X Buffer H 2,0 3 Enzyme ECoRV 1,0 4 Sản phẩm PCR 3,0 Tổng thể tích 20,0 Điều kiện: Ủ 37o C trong 15 phút
Điện di: [5.0 µl/lane trước cắt và 20 µl/lane sau cắt] [Gel agarose 2% - chạy 100V 30’ – 60’]
c. Đột biến gen NPM1-mutA Trình tự mồi:
NPM-mutA forward: 5’-CCAAGAGGCTATTCAAGATCTCTCTC-3’ NPM-REV-6: 5’-ACCATTTCCATGTCTGAGCACC- 3’
Thành phần phản ứng:
Bảng 7. Thành phần và thể tích master mix của phản ứng RT - PCR nhân đoạn gen NPM1-mutA
STT Sinh phẩm Thành phần/1 phản ứng (µl) 1 1X PCR supper mix 22,0 2 NPM1 mutA-F 10 pM 1,0 3 NPM1 mutA-R6 10 pM 1,0 4 Sản phẩm cDNA 1,0 Tổng thể tích 25,0 Chu trình nhiệt: 950C 4' |950C 30" 670C 45" 720C 30”|x40 720C 1' 150C forever
Điện di: [12 µl/lane] [Gel agarose 2% -- chạy 100V 30’ – 60’]
2.3.4.6. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose
Đối với FLT3-ITD: lấy 12 µl sản phẩm PCR để điện di, sử dụng gel agarose 3%, chạy 100V trong 30-60 phút.
Đối với FLT3-TKD: lấy 5 µl sản phẩm PCR trước cắt enzyme và 20 µl sản
phẩm sau cắt enzyme để điện di, sử dụng gel agarose 2%, chạy 100V trong 30-60 phút. Đối với NPM1-mutA: lấy 12 µl sản phẩm PCR để điện di, sử dụng gel
agarose 2%, chạy 100V trong 30-60 phút.
* Phân tích kết quả trên hệ thống máy đọc geldoc UPV Phân tích kết quả
Yêu cầu: Chứng H2O không được xuất hiện băng bất kỳ; chứng người bình thường khơng được xuất hiện băng trùng kích thước đột biến; chứng dương chỉ lên băng đúng kích thước.
TH: Mẫu xuất hiện băng trùng kích thước với đột biến nào thì bệnh nhân mang đột biến tương ứng.
Băng đột biến FLT3 – ITD có kích thước trong khoảng 148 bp – 364 bp.
Băng nội kiểm (control) 133 bp
Băng đột biến FLT3 – ITD Xuất hiện trong khoảng 148 bp – 364 bp Đột biến FLT3 – TKD được nhận biết như sau:
Băng sản phẩm Enzyme cắt EcoRV
Băng sản phẩm PCR
Băng kiểu dại 308 bp và 172 bp 480 bp
Băn đột biến FLT3 –TKD 480 bp 480 bp
Đột biến NPM1-mutA có kích thước 320 bp. Mẫu âm tính sẽ khơng xuất hiện sản phẩm PCR.
2.4. Xử lý số liệu
Số liệu thu thập được trong nghiên cứu: giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, so sánh sự chênh lệch giữa hai biến (giá trị p) được phân tích bằng phần mềm thống kê SPSS 16.0.
2.5. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu
Nghiên cứu nhằm mục đích chẩn đốn, phân loại bệnh chính xác giúp cho q trình chẩn đốn, điều trị và tiên lượng bệnh được hiệu quả, chính xác. Tất cả các xét nghiệm được thực hiện với mẫu bệnh phẩm của người bệnh, người bệnh đồng ý tham gia nghiên cứu.
Mọi thông tin của người bệnh đều được sử dụng dưới dạng số và mã hóa, khơng sử dụng tên và các thơng tin cá nhân của người bệnh.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Hồn thiện quy trình phát hiện đột biến FLT3 và NPM1-mutA
3.1.1. Tách chiết RNA từ mẫu máu ngoại vi và dịch tủy xương
Chúng tôi tiến hành thu thập từ mẫu máu ngoại vi hoặc dịch tủy xương của người bệnh được chẩn đoán là AML tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, sau đó tiến hành tách bạch cầu và tách RNA bằng kit OMEGA (ở mục 2.3.4.1 và 2.3.4.2, chương 2).
RNA được định lượng trên máy đo quang phổ Nano drop ở bước sóng 260nm (A260) cho thấy các mẫu RNA có nồng độ từ 76 ng/µl đến 1457,5 ng/µl, trung bình là 472,3 ng/µl ± 247,8.
Tỷ số A260/A280 đạt từ 1,91 – 2,1 cho thấy RNA đã tinh sạch
Nồng độ RNA của các mẫu có sự chênh lệch nhau có thể do lấy máu ở các thời điểm khác nhau của bệnh hoặc người bệnh nghèo bạch cầu do bệnh lý. Theo nghiên cứu của Kiều Thị Vân Oanh (2013) có khoảng 6% thường hợp AML có số lượng bạch cầu < 4 G/L [7]. Tương tự, tác giả Thiede (2007) có khoảng 7% người bệnh AML có số lượng bạch cầu < 7 G/L [55].
Tuy vậy, tất cả các mẫu tách RNA đều đảm bảo chất lượng cho phản ứng. Kết quả tách RNA cụ thể được trình bày trong Phụ lục.
3.1.2. Nhân bản đoạn gen chứa đột biến FLT3 - ITD
Chúng tơi hồn thiện quy trình bằng hóa chất, sinh phẩm hiện có của Invitrogen - Thermo Fisher, dựa trên trình tự mồi và quy trình cơ bản theo nghiêm cứu của Kioyi và cộng sự 1999 [36]. Cặp mồi đặc hiệu trong nghiên cứu đột biến FLT3 - ITD có
kích thước 330 bp.
Các mẫu được chọn làm xét nghiệm là các mẫu đã được loại trừ các đột biến khác trong AML và nghi ngờ mang đột biến FLT3 - ITD.
Để hồn thiện quy trình chúng tơi sử dụng enzyme Jumstart Taq hiện có thay cho Ampli Taq Gold của quy trình ban đầu. JumpStart Taq DNA Polymerase được thiết kế để giảm thiểu sự khuếch đại các sản phẩm không đặc hiệu và tăng lượng sản phẩm đích.
Quy trình được chạy PCR với chu trình nhiệt:
950C 9' |940C 30" 560C 1ʹ 720C 2ʹ|x35 720C 10' forever
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 3% thu được kết quả như sau:
Hình 10. Sản phẩm FLT3-ITD được điện di trên gel agarose
Giếng 1 - 7: mẫu của người bệnh AML; Giếng 8: POS; Giếng 9: Marker 100bp; Giếng 10: NC; Giếng 11: H2O
Kết quả điện di cho thấy ở tất cả các mẫu đều xuất hiện băng rõ nét giống mẫu NC, ngoài băng giống băng kiểu dại 133 bp cịn xuất hiện thêm các băng khác có kích thước lớn hơn 133 bp. So sánh với thang marker thấy rằng các mẫu này có thể chứa đột biến ITD. Ngồi ra, sản phẩm sau điện di cịn cho thấy trong các mẫu cịn suất hiện nhiều băng có kích thước và độ đậm nhạt của băng khác nhau do vậy kết quả điện di không đặc hiệu cho việc phát hiện đột biến.
Chúng tôi tiến hành tối ưu nhiệt độ gắn mồi nhằm giúp cho phản ứng PCR đạt hiệu quả cao nhất.
Wt 133bp Giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 500 bp Mẫu
160 bp
Về nhiệt độ gắn mồi: nhiệt độ Tm của 2 mồi xuôi và mồi ngược lần lượt là 560C và 580C, nhiệt độ gắn mồi theo quy trình ban đầu là 560C. Để tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi chúng tôi đã tiến hành phản ứng thử nghiệm với nhiệt độ khác nhau là 520C, 550C, 580C và 600C. Kết quả cho thấy ở nhiệt độ 550C thì sản phẩm PCR sau khi điện di cho băng rõ nét nhất nên chúng tôi chọn nhiệt độ 550C để tiến hành cho các phản ứng tiếp theo.
Một số thành phần trong phản ứng RT-PCR như nồng độ mồi, nồng độ Enzyme, nồng độ cDNA có thể gây ảnh hưởng đến sản phẩm của quá trình nhân bản gen. Theo nghiên cứu của Kiyoi năm 1999, nồng độ mồi sử dụng là 50 pmol, sau khi sử dụng chúng tơi thấy mồi cịn thừa nhiều và tạo thành băng, do vậy chúng tôi đã thay đổi nồng độ mồi về mức tối ưu nhất. Sau khi tiến hành nhân bản nhiều lần với các nồng độ mồi khác nhau, kết quả cho thấy nồng độ mồi 10 pmol phản ứng RT-PCR cho kết quả tốt, không thừa mồi sau phản ứng.
Hình 11. Hình ảnh điện di sản phẩm FLT3-ITD sau khi thay đổi nhiệt độ và nồng độ mồi
Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8: mẫu của người bệnh AML; ; Giếng 6: Marker 100bp; Giếng 9: POS; Giếng 10: NC; Giếng 11: H2O
Kết quả điện di cho thấy ở tất cả các mẫu đều lên băng rõ nét, khơng xuất hiện băng phụ, có kích thước khác nhau khoảng từ 150 bp đến 250 bp. Theo nghiên cứu của Kioyi thì đột biến FLT3-ITD là lặp đoạn nội phân tử có nhiều biến thể khác
226bp wt 133bp
Mẫu
nhau, đoạn lặp có kích thước từ 3 bp đến 400 bp và vị trí các đoạn lặp lại khác nhau tùy từng trường hợp. Trong đó, kích thước các đột biến là một yếu tố ảnh hưởng đến chức năng của gen, cũng như protein của FLT3. Theo nghiên cứu của Meshinch và cộng sự (2008), đã chỉ ra rằng độ dài các đột biến FLT3 - ITD có vai trị quan trọng trong việc tiên lượng bệnh, nếu đột biến càng dài thì càng gây ảnh hưởng đến nhiều phần chức năng của protein FLT3 làm tiên lượng càng xấu [43].
Để khẳng định kết quả chúng tơi tiến hành giải trình tự các mẫu có băng kích thước khác nhau bằng phương pháp NGS.
Các mẫu được chọn giải trình tự có kích thước khác nhau là mẫu 3 và mẫu 5, hai mẫu này có kích thước băng giống với các mẫu cịn lại. Sau khi so sánh trình tự các mẫu nghi ngờ mang đột biến ITD được giải trình tự bằng phương pháp NGS và trình tự kiểu dại của gen FLT3-ITD tham chiếu trên NCBI (MN-0041192). Kết quả so sánh cho thấy mẫu 3 có đoạn lặp 93 nucleotide, mẫu 5 có trình tự lặp 27 nucleotide (hình 12). Như vậy, các mẫu này đều mang đột biến lặp đoạn ITD với kích thước đoạn lặp khác nhau.
Qua nhiều bước tối ưu chúng tơi đã hồn thiện quy trình với thành phần và chu trình nhiệt như sau: H2O: 15,0µl; 10X PCR Buffer: 2,5µl; dNTPs 2.5 mM: