1.3.4.2. Một số đại lƣợng đặc trƣng của sắc ký lỏng [2]
Thời gian lƣu (tR)
Khi được nạp vào cột sắc ký, các chất phân tích sẽ bị giữ lại trên cột trong một khoảng thời gian nhất định. Đó chính là thời gian lưu của nó, tính từ lúc mẫu được nạp vào cột cho đến lúc chất tan được rửa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại
Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa Phân tích
tRi = to + t’Ri
Trong đó: to là thời gian chết (thời gian chất phân tích nằm trong pha động)
t’Ri là thời gian lưu giữ thực của chất phân tích trên cột tách
Hệ số đối xứng pic
Để đánh giá tính đối xứng của pic sắc ký ta có thể dùng hệ số đối xứng S theo công thức:
A B
S
Trong đó:
A là khoảng cách từ chân đường vng góc hạ từ đỉnh pic đến mép
đường cong phía trước tại vị trí 1/10 chiều cao pic.
B: khoảng cách từ chân đường vng góc hạ từ đỉnh pic đến mép
đưịng cong phía sau tại vị trí 1/10 chiều cao pic.
Độ phân giải
Độ phân giải là đại lượng đặc trưng biểu thị độ tách 2 chất ra khỏi nhau. Độ phân giải nếu lớn hơn 1,5 thì 2 pic tách nhau hồn tồn, trong khi độ phân giải bé hơn 0,75 thì khơng tách được. Trong phân tích định lượng độ phân giải bằng 1 được chấp nhận, và khi đó độ xen phủ 2 pic là khoảng 4%.
Cơng thức tính độ phân giải:
𝑅𝑆 =2 𝑡𝑅𝐴 − 𝑡𝑅𝐵 𝑤𝐴+ 𝑤𝐵
Trong đó: RS là độ phân giải pic
tRA, tRB là thời gian lưu của chất A, B
wA, wB là độ rộng chân pic
1.4. Các phƣơng pháp xử lý mẫu
Một trong những yếu tố quyết định đến hiệu quả của phương pháp định lượng đó là phương pháp xử lý mẫu. Nhiều phương pháp xử lý khác nhau đã được
Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa Phân tích
ứng dụng để phân tích parabens: phương pháp chiết pha rắn SPE [10], phương pháp chiết vi lượng lỏng-lỏng phân tán DLLME [26], chiết có sự hỗ trợ của sóng siêu âm UAE [17], [18], chiết lỏng có hỗ trợ áp suất PLE [7], [4], [16], chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn SFE [22].
Tác giả Cristina Moreta và cộng sự [10] xử lý mẫu dược phẩm bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE). Mẫu phân tích được xử lý theo quy trình sau: cân 0,05 g đến 0,1 g mẫu, thêm 0,2 mL hỗn hợp chất nội chuẩn 1mg/mL và 4,5 mL dung dịch MeOH. Lắc đều hỗn hợp bằng máy lắc nghịch đảo trong 30 phút. Quay ly tâm ở 5000 vịng/phút trong 15 phút và sau đó tách lấy phần dịch. Các mẫu khơng chứa dầu được phân tích bằng HPLC-MS/MS. Các mẫu lỏng và softgel chứa dầu tiếp tục được làm sạch bằng chiết pha rắn trước khi phân tích.
Nhóm tác giả sử dụng cột chiết là cột Stratas NH2 (55 mm, 70 Å, 200
mg/3mL) của hãng Phenomenex (Hoa Kỳ) để tinh lọc mẫu. Cho 4 ml của dung dịch chuẩn chứa 100 ng/mL hỗn hợp các chất cần phân tích và 50 ng/mL chất nội chuẩn
vào một ống nhựa trước khi tinh lọc. Với cột NH2 dịch chiết được cơ đặc xuống thể
tích nhỏ hơn 0,2 ml nhờ dịng khí nito (N2) và được hịa tan lại bằng 2 ml hồn hợp
dichloromethane/hexane (30:70) và chuyển tới cột Strata NH2. Trước đó, cột được
hoạt hóa bằng 4 ml hỗn hợp aceton/MeOH (20:80) và 4 ml hexane. Sau đó, cột được rửa sạch bằng 4 ml hexane và sấy khô bằng chân khơng trong 10 phút. Chất phân tích được rửa giải bằng 3 ml aceton/MeOH (20:80).
Nhóm tác giả cũng đồng thời thử nghiệm cột Oasiss HLB (3cc, 60 mg) của hãng Water (Hoa Kỳ) cho việc tinh lọc dịch chiết. Dịch chiết được cô đặc tới 2 ml
nhờ dịng khí N2 và thêm 6 ml nước cất. Cột Oasiss HLB được hoạt hóa bằng 3 ml
MeOH và 3 ml nước. Sau khi nạp mẫu, cột được rửa bằng 3 ml dung dịch MeOH 10% trong nước và 3 ml nước. Sau đó, sấy khơ cột trong chân khơng trong 10 phút và chất phân tích được rửa giải bằng 3 ml MeOH.
Phương pháp chiết vi lượng lỏng-lỏng phân tán (DLLME) được tác giả
Luận văn Thạc sĩ Chun ngành: Hóa Phân tích
mẫu thực phẩm. Q trình thực hiện như sau: Chuyển 1,0 ml dung dịch mẫu tới ống ly tâm polypropylene hình nón có thang chia độ. Thêm 100 µl axit photphoric đậm đặc, 200 µl chloroform và 1,0 ml ACN, rồi định mức tới 8,0 mL bằng nước và lắc xoáy trong 1 phút. Sau đó quay ly tâm 4000 vòng/phút, trong vòng 3 phút. Phần dung dịch được chuyển tới vi ống khóa lị xo 1,0 ml. Sau khi lắc xốy trong 10s và quay ly tâm 4000 vịng/phút, trong 1 phút, parabens được chiết ngược trong 80 µl BES (dung dịch natri hydroxit 50 mM, pH 12,7) để bơm trực tiếp vào máy điện di mao quản.
Phương pháp chiết có sự hỗ trợ của sóng siêu âm (Ultrasonic Assisted Extraction UAE) cũng được ứng dụng trong phân tích các parabens. Năng lượng của sóng siêu âm, cùng với điều kiện nhiệt độ cao thúc đẩy nhanh quá trình phá hủy cấu trúc mẫu, giúp giảm thời gian xử lý mẫu và năng cao hiệu quả quá trình chiết mẫu.
Tác giả Nunez L. và cộng sự [17], [18] áp dụng phương pháp chiết có hỗ trợ sóng siêu âm (UAE) để chiết parabens có trong nền mẫu đất và trầm tích. Mẫu phân tích được cho vào ống thủy tinh có chứa polyethylene ở cuối ống, sau đó chiết 2 lần bằng dung mơi ACN với thể tích dung mơi thêm vào lần lượt là 7 ml và 3 ml, rung siêu âm với tần số 50-60 Hz trong bể rung trong thời gian 15 phút. Dung dịch chiết sau khi tách riêng được bay hơi đến thể tích 1ml, sau đó đem phân tích bẳng phương pháp LC–MS/MS.
Chiết lỏng có hỗ trợ áp suất (Pressurized Liquid Extraction PLE) được ứng dụng để chiết parabens trong các nền mẫu khác nhau như: bụi trong nhà [7], trong đất [4], bùn cống [16].
Tác giả Canosa P. và cộng sự [7] phân tích 4 parabens là methylparaben,
ethylparaben, propylparaben, butylparaben, và triclosan (TCS) có trong bụi trong nhà. Sau khi thu thập bụi, tiến hành chiết PLE qua hai giai đoạn. Trong 10 phút đầu, các chất hữu cơ có độ phân cực thấp hơn parabens và triclosan (TCS) được loại bỏ
bằng n-hexan tại nhiệt độ 400C và áp suất 3,4 Mpa. Sau đó chất phân tích được rửa
Luận văn Thạc sĩ Chun ngành: Hóa Phân tích
Tiếp theo, chất phân tích được thu hồi bằng ethyl acetate trong 3 chu trình, ở nhiệt
độ 1030C và áp suất 13,8 MPa, tổng lượng dung dịch sử dụng là 11 ml. Dịch chiết
etyl acetate (khoảng 15 ml) được làm bay hơi xuống thể tích 2 ml, sau đó lọc và phân tích bằng phương pháp GC-MS/MS.
Tác giả Albero B. và cộng sự [4] áp dụng phương pháp chiết có hỗ trợ áp suất (PLE) để nghiên cứu các hợp chất hữu cơ gây ô nhiễm có trong đất, trong đó có
các hợp chất parabens. Trong nghiên cứu này nhiệt độ chiết tối ưu là 1000C, áp suất
là 120 bar, dung môi chiết là ethyl acetate.
Tác giả Nieto A. và cộng sự [16] phân tích hàm lượng của 4 parbens (bao
gồm methylparaben, ethylparaben, propylparaben và butylparaben) và 2 chất kháng sinh có trong bùn thải bằng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC). Quá
trình chiết mẫu theo phương pháp PLE được thực hiện ở nhiệt độ 1000C và áp suất
140 bar. Dung môi chiết là dung dịch hỗn hợp MeOH:nước với tỉ lệ 50:50.
Một phương pháp khác là chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn (supercritical
fluid extraction SFE) được tác giả Shu Ping Wang và cộng sự [22] áp dụng. Nhóm
tác giả đã sử dụng chất lỏng siêu tới hạn là CO2 để chiết tách parabens trong nền mỹ
phẩm. Phương pháp này có ưu điểm là thân thiện với mơi trường, không độc hại đối với sức khỏe của con người, và hiệu quả chiết rất cao. Tuy nhiên, chiết suất bằng chất lỏng siêu tới hạn địi hỏi chi phí đầu tư máy móc ban đầu rất lớn, khơng phù hợp với điều kiện thực tế của các phịng thí nghiệm trong nước.
Tóm lại, có rất nhiều phương pháp chiết khác nhau đã được ứng dụng trong q trình phân tích các parabens. Để tách các parabens ra khỏi nền mẫu mỹ phẩm và thực phẩm chức năng, chúng tơi lựa chọn phương pháp chiết có sự hỗ trợ sóng siêu âm (UAE). Vì phương pháp này cho hiệu quả tách tốt, khơng địi hỏi máy móc phức tạp, phù hợp với điều kiện máy móc thực tế của phịng thí nghiệm.
Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa Phân tích
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
- Xây dựng và chuẩn hóa phương pháp định lượng 7 parabens nêu trên bằng phương pháp sắc ký lỏng kết hợp với đầu dò khối phổ.
- Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng parabens trên một số mẫu mỹ phẩm, thực phẩm chức năng.
2.2. Đối tƣợng nghiên cứu
Các loại mỹ phẩm sử dụng ngoài da: sữa rửa mặt, kem dưỡng da, khăn ướt v.v., các mẫu thực phẩm chức năng dạng siro, viên nang cứng, viên nang mềm v.v..
2.3. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát tìm các điều kiện phân tích 7 parabens bằng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng kết hợp với đầu dò khối phổ (UPLC-MS/MS).
- Khảo sát xây dựng quy trình xử lý mẫu, tách chiết các parabens ra khỏi nền mẫu mỹ phẩm và thực phẩm chức năng.
- Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp.
- Áp dụng quy trình khảo sát phân tích các mẫu thực.
2.4. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
2.4.1. Hóa chất
- Chất chuẩn methylparaben, propylparaben, độ tinh khiết >99,0% (Sigma- Aldrich, Hoa Kỳ)
- Chất chuẩn isopropylparaben, isobutylparaben, phenylparaben, độ tinh khiết >99,0% (TCI, Nhật Bản).
- Chất chuẩn benzylparaben, pentylparaben, độ tinh khiết >98,0% (TCI, Nhật Bản).
Luận văn Thạc sĩ Chun ngành: Hóa Phân tích
Các loại hóa chất, dung môi khác:
- Methanol (Merck, 99,9%)
- Amoniacetat CH3COONH4(Merck, ≥98,0 %)
- Acid formic HCOOH (Merck 99,8-100%) - MeOH (>95%, Trung Quốc)
-EtOH (>95%, Trung Quốc) - Nước cất 2 lần
Pha dung dịch chuẩn:
- 7 parabens nghiên cứu đều là các hợp chất có tính phân cực, nhưng do độ phân cực khác nhau, dẫn đến khả năng tan trong nước của chúng khác nhau. Tham khảo các tài liệu và khảo sát thực tế tại phịng thí nghiệm chúng tơi lựa chọn MeOH để pha dung dịch chuẩn gốc. Vì dung mơi nước chỉ hòa tan tốt methylparaben, propylparaben và isopropylparaben, với các paraben còn lại, sau khi pha một thời gian ngắn xuất hiện tình trạng bị lắng cặn.
- Cân 0,01 gam từng chất chuẩn trên cân phân tích có độ chính xác ± 0,0001 gam, hòa tan và định mức 50 ml bằng MeOH. Khối lượng cân thực tế và nồng độ các chuẩn tổng hợp trong Bảng 2.1:
Bảng 2. 1. Bảng nồng độ dung dịch chuẩn gốc của 7 parabens
Khối lượng cân (gam) C (ppm)
Methylparaben 0,0112 224 Propylparaben 0,0102 204 Isopropylparaben 0,0113 226 Isobutylparaben 0,0125 250 Benzylparaben 0,0103 206 Pentylparaben 0,0160 320 Phenylparaben 0,0104 208
Luận văn Thạc sĩ Chun ngành: Hóa Phân tích
Dung dịch chuẩn được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 40C trong 3 tháng.
Dung dịch làm việc được pha loãng trong nước.
2.4.2. Dụng cụ
- Bộ lọc pha động. - Ống ly tâm nhựa 50ml.
- Ống đong dung tích 10, 25, 50, 100ml.
- Pipetman 200µl, 1000µl; pipet pasteur 5ml, đầu côn. - Vial loại 1,8ml.
- Bình định mức dung tích 5, 10, 25, 50, 100 ml.
2.4.3. Thiết bị
- Hệ thống máy sắc ký lỏng siêu hiệu năng ACQUITY UPLC I-Class, được trang bị nguồn ion hóa tia điện ESI (Waters, Hoa Kỳ).
- Cột sắc ký Waters XBridge TM C18 (150 mm ì 2,1 mm ì 1,8 àm) (Waters,
Hoa Kỳ).
- Máy lắc vortex (IKA, Đức).
- Máy nước cất 2 lần (HAMILTON, Anh).
- Máy ly tâm Miko 220R, có chế độ ly tâm lạnh, tốc độ tối đa 6000 vòng/phút (Hettich, Đức)
- Bể rung siêu âm có chế độ gia nhiệt (Elma, Đức).
- Cân phân tích có độ chính xác 0,1mg và 0,01mg (Kern, Đức). - Cân kĩ thuật (có độ chính xác 0,01g).
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
Các parabens được phân tích bằng phương pháp UPLC-MS/MS, trong đó các phân tử chất phân tích được ion hóa bằng kỹ thuật ESI. Do vậy, trước tiên các thông số cho detector MS được khảo sát sao cho cường độ của pic ion sơ cấp là lớn nhất, sau đó tiến hành khảo sát các điều kiện đo trên máy HPLC.
Các parabens được tách ra khỏi nền mẫu bằng phương pháp chiết có hỗ trợ sóng siêu âm (UAE).
Luận văn Thạc sĩ Chun ngành: Hóa Phân tích
2.5.1. Xác định các điều kiện phân tích
2.5.1.1. Xác định các thông số cho detector khối phổ
Xác định các điều kiện cho khối phổ được thực hiện tự động bằng phần mềm IntelliStart. Hai thông số cần tối ưu là: Cone Voltage (điện thế cone): chọn giá trị tại đó cường độ pic của ion sơ cấp (ion mẹ) là lớn nhất. Collision energy (năng lượng va chạm): chọn giá trị ứng với cường độ pic của mỗi mảnh là lớn nhất. Mỗi một ion con sẽ có một giá trị Collision energy tối ưu tương ứng.
Cone Voltage được khảo sát trong khoảng từ 2-100 V, Collision energy khảo sát trong khoảng từ 2-80 V.
2.5.1.2. Khảo sát điều kiện đo sắc ký
Đối với phương pháp sắc ký lỏng, thành phần pha động ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả tách chất. Pha động phải đảm bảo yêu cầu sao cho các pic chất cần phân tích trong sắc ký đồ khơng bị chập với các pic nhiễu khác, khả năng tách rõ ràng, ít bị dỗng pic, thời gian lưu khơng được quá dài. Dựa vào các tài liệu tham
khảo chúng tôi lựa chọn pha động sau: kênh A là dung dịch hỗn hợp CH3COONH4
và HCOOH, kênh B là ACN. Để xác định các điều kiện đo sắc ký, chúng tôi tiến hành khảo sát lần lượt các yếu tố sau:
- Khảo sát chương trình rửa giải gradient. - Khảo sát thành phần dung dịch đệm.
Để đánh giá hiệu quả phân tích, chúng tơi dựa vào độ phân giải của các píc sắc ký được tính theo cơng thức trong mục (1.3.4.2).
2.5.1.3. Khảo sát các điều kiện chiết mẫu
Dựa theo tài liệu tham khảo [17], [18] và điều kiện thực tế của phịng thí nghiệm, xây dựng một quy trình phân tích mẫu dự kiến như sau: mẫu được đồng nhất kỹ. Sau đó cân mẫu vào ống ly tâm nhựa 50 ml. Thêm 30 mL dung môi chiết mẫu vào ống ly tâm trên. Lắc ống nghiệm để mẫu và dung môi được đảo trộn đều. Rung siêu âm để tăng khả năng hịa tan của chất phân tích. Để nguội đến nhiệt độ phòng, rồi ly tâm với tốc độ cao để phân tách phần dung dịch và lắng chặt phần cặn. Phần dịch trong được gạn vào bình định mức 50 ml, phần cặn được chiết lặp lại với
Luận văn Thạc sĩ Chun ngành: Hóa Phân tích
15 ml dung môi chiết ở trên. Định mức đến vạch bằng dung mơi chiết. Sau đó lọc và đem phân tích trên hệ thống UPLC-MS/MS.
Hình 2. 1. Lược đồ quy trình phân tích mẫu theo dự kiến
Chiết lặp UPLC-MS/MS Cặn Gạn dịch chiết vào bình định mức 50 ml Định mức đến vạch Để nguội Lắc vortex Ly tâm 6000 vòng/phút /5 phút Lọc
Rung siêu âm (nhiệt độ, thời gian) + Dung môi
chiết
Cân mẫu vào ống ly tâm 50ml
+ Dung môi chiết
Luận văn Thạc sĩ Chun ngành: Hóa Phân tích
Dựa theo quy trình dự kiến, chúng khảo sát các điều kiện chiết mẫu, bao gồm:
- Khảo sát loại dung môi chiết.
- Khảo sát thành phần dung môi chiết. - Khảo sát thời gian rung siêu âm. - Khảo sát nhiệt độ rung siêu âm.
Để đánh giá hiệu quả quá trình chiết mẫu, đối với các parabens đã có sẵn trong nền mẫu thực, chúng tơi tính tốn hàm lượng chất phân tích trong mẫu dựa vào cơng thức: 𝐻à𝑚 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑚𝑔 𝑘𝑔 =𝐶. 𝑉. 𝑘 𝑚 Trong đó: C là nồng độ chất phân tích (ppm) V là thể tích định mức (ml) k là hệ số pha loãng
m là khối lượng mẫu (gam)
Đối với các parabens khơng có trong nền mẫu thực, chúng tơi tiến hành khảo sát trên nền mẫu thêm chuẩn, hiệu quả của quá trình chiết được đánh giá dựa và hiệu suất thu hồi, tính theo cơng thức sau: