3.2. Tạo chủng Streptomyces rapamycinicus chuyển gen
3.2.2. Kiểm tra chủng xạ khuẩn chuyển gen bằng phương pháp lai Southern Blot
Mẫu ADN sau khi xử lý với ARNase qua đêm cho thấy chất lượng tốt trên bản gel sau điện di (Hình 3.8). Chất lượng ADN chuẩn bị cho thí nghiệm lai Southern Blot được đánh giá bằng Nanodrop và giá trị A230/A260 thu được là 1,8 – 2,0, nồng độ ADN của các mẫu I1, I7, I18 lần lượt là 65; 36,6 và 343 ng/µL. Mẫu ADN tổng số của các chủng xạ khuẩn hoang dại và đột biến được cắt bằng cặp enzyme giới hạn BamHI và KpnI.
Kết quả lai Southern blot với đầu dò là sản phẩm PCR của gen rapG cho thấy trong điện di đồ ứng với chủng xạ khuẩn hoang dại có một băng kích thước khoảng 5,5 kb lai được với đầu dò, trong khi điện di đồ ứng với chủng xạ khuẩn chuyển gen I18 có hai băng kích thước khoảng 5,5 kb (giống chủng dại) và 4,0 kb lai được với đầu dị (Hình 3.9). Điện di đồ ứng với các chủng xạ khuẩn I1 và I7 không xuất hiện băng sáng nào, có thể do lượng ADN tổng số không đủ để phản ứng lai thành công hoặc để quan sát được kết quả lai, hay do lỗi kỹ thuật trong quá trình lai. Tuy nhiên, vì mục đích cuối cùng của chúng tơi là tìm được một chủng xạ khuẩn chuyển gen mang thêm gen rapG và kết quả cho thấy chủng I18 đã đáp ứng yêu cầu này nên
chúng tơi khơng làm tiếp các thí nghiệm với I1 và I7. Chủng xạ khuẩn chuyển gen I18 được đặt tên là chủng S. rapamycinicus WT/rapG.
Hình 3.9. Kết quả lai Southern blot của các chủng xạ khuẩn chuyển gen (I1, I7, I18) và chủng hoang dại (WT) (I1, I7, I18) và chủng hoang dại (WT)
3.3. Tối ưu hóa điều kiện sinh rapamycin
Đường chuẩn rapamycin được xây dựng để định lượng nồng độ rapamycin môi trường nuôi cấy và tách chiết. Các giá trị area (diện tích đỉnh hấp thụ) tại bước sóng 272 nm được thể hiện trong bảng 3.1. Phương trình đường chuẩn rapamycin như sau: y = 0,0241x – 0,5182, trong đó: x là giá trị area, y là giá trị rapamycin tương ứng với x (mg/L).
Bảng 3.1. Các giá trị dựng đường chuẩn rapamycin STT Lượng rapamycin (mg/L) Area STT Lượng rapamycin (mg/L) Area
1 61,29 2537,3
2 30,40 1298,8
3 15,20 727,2
4 10,13 388,1
5 3,04 127,8
Hình 3.10. Đường chuẩn rapamycin
Các mẫu dịch sau tách chiết được thử hoạt tính kháng nấm C. albicans đều cho vịng hoạt tính kháng lớn, các mẫu có đường kính kháng khuẩn lên tới 25 mm (Hình 3.11.). Tuy nhiên, khi chạy phân tích mẫu bằng HPLC, lượng rapamycin thu được ở các mẫu này có sự khác nhau rõ rệt. Do đó, định lượng rapamycin bằng phân tích HPLC là cần thiết bên cạnh phương pháp đo đường kính kháng C. albicans ban đầu. Trong các thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi sẽ định lượng và phân tích lượng rapamycin thu được bằng phân tích HPLC.
Hình 3.11. Vịng kháng nấm C. albicans của các chủng xạ khuẩn WT và WT/rapG trong các môi trường nuôi cấy khác nhau
Để xác định mơi trường ni cấy thích hợp làm tăng khả năng sinh rapamycin của các chủng xạ khuẩn WT và WT/rapG, chúng tôi tiến hành nuôi các chủng xạ khuẩn này trong môi trường MD1, MD2 và MD3. Thành phần môi trường được thể hiện chi tiết trong phần phương pháp. Nồng độ rapamycin trong các môi trường nuôi cấy gốc của chủng WT và WT/rapG được thể hiện qua hình 3.12.
Khi ni hai chủng xạ khuẩn WT và WT/rapG trong môi trường MD1, lượng rapamycin thu được của chủng WT (79,2 mg/L) tương đương với lượng rapamycin của chủng WT/rapG (75,1 mg/L). Trong môi trường MD2, chủng WT/rapG cho lượng rapamycin thu được (27,4 mg/L) cao hơn gấp 5 lần so với chủng WT (5 mg/L) và trong mơi trường MD3 khơng có sự khác biệt về lượng rapamycin thu được giữa hai chủng. Trong ba môi trường MD1, MD2 và MD3, nguồn cung cấp năng lượng ban đầu là các loại đường. Đối với môi trường MD1 sử dụng dextrin, lượng rapamycin thu được cao hơn so với MD2 và MD3 sử dụng glucose. Dextrin đã được chứng minh là yếu tố tích cực tới khả năng sinh rapamycin tốt hơn so với glucose [26]. Hàm lượng glucose trong môi trường MD2 (20 g/L) cao hơn MD3 (6 g/L) và lượng rapamycin thu được trong môi trường MD2 cao hơn MD3. Kết quả này chứng tỏ rằng các nguồn cung cấp năng lượng khác nhau có ảnh hưởng tới lượng sản phẩm rapamycin thu được. Do đó, giả thuyết chúng tơi đặt ra là q trình sinh tổng hợp rapamycin gồm hai giai đoạn: giai đoạn đầu, tế bào xạ khuẩn cần nguồn năng lượng để tổng hợp các chất sơ cấp, chất cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển; giai đoạn hai là giai đoạn sinh tổng hợp rapamycin, các yếu tố ảnh hưởng đến lượng rapamycin có thể ảnh hưởng tới giai đoạn một hoặc hai.