Nồng độ dãy chuẩn của chất phân tích(ppm)
Chất PT(ppm) C0 C1 C2 C3 C4 C5
Các chất khác Nhƣ nhau
Độ hấp thụ quang
0,00 Ims 1 Ims 2 Ims 3 Ims 4 Ims 5
Rồi từ các cặp giá trị Ims /C này của chất phân tích trong dãy mẫu chuẩn, ta dựng đƣờng chuẩn theo hệ toạ độ Ims – C. Đƣờng này chính là đƣờng chuẩn (hay cũng chính là đƣờng cong lấy mẫu) để xác định nồng độ Cx chƣa biết của nguyên tố phân tích X trong các mẫu phân tích.
Phƣơng pháp này rất thuận lợi khi phân tích hàng loạt mẫu của cùng một đối tƣợng, nó nhanh và dễ thực hiện. Nhƣng điều kiện phân tích phải đảm bảo các mẫu phân tích và mẫu chuẩn có cùng thành phần nền, trạng thái liên kết
của các chất, môi trƣờng,…và ghi phổ trong cùng một điều kiện; mỗi ngày tiến hành phân tích đều phải đo lại phổ của dãy mẫu chuẩn để dựng lại đƣờng chuẩn. Vì thế, nếu phân tích đối tƣợng có thành phần và nền phức tạp, mà chúng ta chƣa biết, thì khó có thể pha chế dãy mẫu chuẩn thoả mãn đủ các điều kiện của phƣơng pháp này. Dẫn đến kết quả thu đƣợc sẽ mắc phải sai số lớn do sự không đồng nhất về thành phần các chất và nền của mẫu gây ra. Đó chính là nhƣợc điểm của phƣơng pháp này. Để khắc phục sai số này, ngƣời ta thƣờng dùng một trong hai cách sau:
- Biến đổi nền của mẫu phân tích sang nền khác (do chúng ta pha chế chính xác).
- Sử dụng phƣơng pháp thêm tiêu chuẩn, nghĩa là sử dụng một dãy mẫu chuẩn phục vụ việc thêm định lƣợng vào quá trình phân tích.
2. Phƣơng pháp thêm tiêu chuẩn
Nguyên tắc
Xác định một nguyên tố phân tích X trong một loại mẫu phân tích, ta dùng một mẫu phân tích đại diện để làm nền, để chuẩn bị một dãy mẫu chuẩn. Sau đó thêm vào các mẫu những lƣợng ∆C thích hợp của chất phân tích X theo từng bậc nồng độ. Tiến hành đo phổ và dùng phƣơng pháp ngoại suy và nội suy tuyến tính để xác định nồng độ của nguyên tố X trong mẫu chọn làm nền và mẫu phân tích.
Cách tiến hành
Thêm vào các mẫu phân tích những lƣợng chính xác các giá trị ∆C1, ∆C2, ∆C3, ∆C4, ∆C5; là nồng độ của nguyên tố phân tích X đƣợc thêm vào dƣới dạng một hợp chất có dạng liên kết phù hợp nhƣ trong mẫu phân tích và theo bội của cấp số cộng. Ví dụ: 5, 10, 15, 20, 25 ppm.
Các mẫu phân tích khác cũng đƣợc chuẩn bị trong cùng một điều kiện nhƣ của dãy mẫu chuẩn. Khi đó chúng ta có các mẫu phân tích là: C1x, C2x, C3x, C4x, C5x. Nhƣ vậy là chúng ta có một dãy mẫu chuẩn và các mẫu phân tích đã đƣợc chuẩn bị nhƣ nhau.
Tiếp theo chúng ta tiến hành đo phổ của dãy mẫu chuẩn và các mẫu phân tích theo những điều kiện phù hợp của quy trình phân tích đã chọn.
Hình 1: Đường chuẩn theo hệ toạ độ Ims – Cx
3. Phƣơng pháp một mẫu chuẩn
Với những chất có vùng tuyến tính của phép đo rộng, nên trong nhiều trƣờng hợp không cần dựng đƣờng chuẩn mà chỉ cần dùng một mẫu chuẩn để tính nồng độ của chất X trong mẫu phân tích.
Cách 1: Dùng mẫu tiêu chuẩn
Nếu mẫu có nồng độ là Cch và mẫu phân tích có nồng độ là Cx, thì ta có: Với mẫu phân tích: Ix = k.Cx
Với mẫu chuẩn: Ich = k.Cch
Do đó chúng ta có: Cx = (Ix / Ich).Cch (c) Nhƣ vậy sau khi đo phổ sẽ thu đƣợc gái trị Ims x và Ims ch, chúng ta dễ dàng tính đƣợc Cx của chất phân tích X trong mẫu phân tích theo biếu thức (c).
Cách này có khó khăn là khi mẫu phân tích có thành phần phức tạp và khơng biết chính xác thì khó chuẩn bị đƣợc một mẫu chuẩn có thành phần và nền giống nhƣ mẫu phân tích, do đó thƣờng mắc phải sai số lớn.
Cách 2: Không dùng mẫu tiêu chuẩn
Nếu mẫu phân tích có nồng độ chƣa biết là Cx, chúng ta lấy 2 lƣợng mẫu nhƣ nhau (có 2 mẫu), một mẫu để nguyên và một mẫu thêm một lƣợng chính xác ∆Cx của chất phân tích X, rồi xử lý trong cùng điều kiện, sau đó tiến hành đo phổ.
Với mẫu phân tích: Ix = k.Cx Với mẫu chuẩn: Itch = k.(Cx + Cx)
Do đó ta có: Cx = (Cx.Ix)/(Itch - Ix) (d) Cách này có ƣu điểm hơn cách 1 là nó loại trừ đƣợc ảnh hƣởng của thành phần và nền của mẫu. Vì chúng ta dùng ngay mẫu phân tích để làm chuẩn theo phƣơng pháp thêm, nên mẫu phân tích và mẫu chuẩn đều có cùng thành phần và chất nền. 0 C1 C2 C3 C4 C5 mg/mL I M C I0 Cx -Cx
CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Để xác định riêng biệt các NTĐH trong hỗn hợp trƣớc tiên phải tách trƣớc khi xác định. Nhƣ đã đề cập ở trên phƣơng pháp đƣợc chọn là phƣơng pháp sắc ký điện di mao quản. Phƣơng pháp này có độ chọn lọc, độ nhạy tƣơng đối cao, tốc độ phân tích nhanh mặt khác cũng là phƣơng pháp mới hiện đại và đang đƣợc ứng dụng rộng rãi.
2.1 Đối tượng và nội dung nghiên cứu.
2.1.1. Đối tượng.
Nghiên cứu, khảo sát, xây dựng phƣơng pháp tách và xác định đồng thời 13 NTĐH trong lớp phủ.
2.1.2. Nội dung nghiên cứu.
Để đạt đƣợc mục tiêu đề ra một số việc cần giải quyết:
-Tổng quan các tài liệu về phƣơng pháp phân tích các NTĐH trong nƣớc và trên thế giới từ trƣớc đến nay.
-Chế tạo dung dịch photphat hoá nguội với các chất phụ gia: Đồng, Niken, Xeri.
-Nghiên cứu chọn điều kiện tối ƣu cho qui trình phân tích nhƣ: pH, nồng độ chất điện ly cho pha động, tách loại chất cản…
-Đánh giá thống kê phƣơng pháp phân tích. -Áp dụng phân tích một số mẫu phủ.
-Đánh giá phƣơng pháp.
2.2. Phương pháp nghiên cứu.
Để thực hiện nhiệm vụ của luận văn kỹ thuật phân tích đƣợc chọn là sắc ký điện di mao quản.
2.2.1. Đại cương về sắc ký điện di mao quản (CEC) [7] A. Lịch sử và phát triển:
Điện di mao quản là kỹ thuật tách chất dựa trên cơ sở sự di chuyển khác nhau của các phân tử chất (chủ yếu là các ion mang điện tích) trong dung dịch chất điện giải có chất đệm pH và trong một từ trƣờng điện E nhất định, do có thế V đặt vào hai đầu mao quản sinh ra. Kỹ thuật tách này đƣợc nghiên cứu và phát triển đầu tiên bởi Tiselius (1973), trên cơ sở tách và phân tích các hỗn hợp protein, amin, amino axit bằng kỹ thuật CE thế thấp (110 đến 220V) Sau gần mƣời năm, với kết quả nghiên cứu và đề xuất ra kỹ thuật tách mới này Tiselius đã nhận đƣợc giải thƣởng Nobel 1949.
Sau đó cùng với sự phát triển kỹ thuật tách khác, kỹ thuật tách và phân tích này cũng đƣợc phát triển và ứng dụng trong mọi lĩnh vực phân tích các chất vơ cơ đến hữu cơ đặc biệt trong lĩnh vực y và sinh học. Đến năm 1967, Hjerten là ngƣời đầu tiên nghiên cứu tiếp một cách hệ thống và mô tả chi tiết , cũng nhƣ hoàn chỉnh cơ sở lý thuyết của sắc ký điện di mao quản trong ống hở. Sau đó là các nhà khoa học Later Virtamen, Mikeers đã tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện kỹ thuật này không những dùng mao quản thuỷ tinh mà cả mao quản Teflon. Tiếp đó Jorgenson đã phân loại về lý thuyết của các kiểu CRC và mô tả cụ thể về các đặc điểm và cách hoạt động của mỗi loại và kỹ thuật tách CE đã phát triển không ngừng.
Vào thập niên 80 để khắc phục những hạn chế của điện di thông thƣờng sắc ký điện di mao quản hiệu suất cao đã đƣợc nghiên cứu và phát triển. Đó là sự kết hợp giữa sắc ký điện di cổ điển với tính chất của cột sắc ký khí mao quản và các detector có độ nhạy cao của sắc ký lỏng hiệu năng cao. Do muốn thực hiện đƣợc điện di trong ống mao quản thì phải áp vào hai đầu mao quản thế cao, vì thế nó cịn có tên là sắc ký điện di mao quản thế cao. Sau những năm 1990 là thời kỳ phát triển mạnh của HPCEC. Hiện nay kỹ thuất HPCEC đang phát triển ở mức độ cao và đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
Đặc điểm của HPCEC
Do đặc thù của PHCEC đó là sự di chuyển khác nhau của các cấu tử chất tan dƣới tác dụng của lực điện trƣờng E của nguồn thế cao đặt vào hai đầu của cột tách, trong môi trƣờng của dung dịch điện ly và chất đệm có pH thích hợp, Vì thế HPCEC có những đặc điểm nhƣ sau:
- Có hiệu lực tách các chất rất cao trong ống mao quản thuỷ tinh hay ống Teflon.
- Thế điện di rất cao, thƣờng từ 10 đến 30KV đƣợc sử dụng để đặt vào hai đầu ống mao quản.
- Số đĩa hiệu dụng của cột tách là rất lớn, thông thƣờng từ 105 đến 106
nên hiệu quả tách tốt - Thời gian tách nhỏ.
- Lƣợng mẫu cần là rất nhỏ, thƣờng từ 5 đến 50 nL (nano lít) cho một lần bơm mẫu vào cột tách.
- Khả năng ứng dụng thực tế là rộng rãi và đa dạng.
- Không tốn dung môi hữu cơ nhƣ trong sắc ký lỏng hiệu năng cao - Việc thực hiện phân tích đơn giản
Các khái niệm
Trong sắc ký điện di mao quản ngƣời ta thƣờng phân chia thành các loại khác nhau, cụ thể gồm các loại nhƣ sau:
- Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis: CZE)
- Sắc ký điện di mao quản điện động học (Micellar Capillary Electro- Kenetic Chlomatography: MCEKC)
- Sắc ký điện di mao quản loại Gel (Capillary Gel Electrophoresis Chromatography: CGEC).
- Sắc ký điện di mao quản hội tụ đẳng nhiệt (Capillary iso-Electric Chromatography: CIEFC)
- Sắc ký điện di mao quản đẳng tốc độ (Capillary Iso Tacho-phoresis chromatography: CITPC).
B. Cơ sở lý thuyết 1. Nguyên tắc 1. Nguyên tắc
Dựa trên tính chất điện di của các phân tử chất tan (các ion) trên nền của dung dịch chất điện ly và chất đệm pH thích hợp trong ống mao quản, dƣới tác dụng của một từ trƣờng điện E xác định, đƣợc cung cấp bởi một nguồi thế cao một chiều (10kV-30kV) đặt vào hai đầu mao quản. Việc dùng cột mao quản có nhiều ƣu việt, nhƣ tốn ít chất mẫu, tốn ít hố chất, số đĩa hiệu dụng lớn, quá trình tách chất nhanh, hiệu quả.
Cơ chế của sự điện di là sự di chuyển khác nhau của các phân tử chất tan (các ion) trong ống mao quản dƣới tác dụng của lực điện trƣờng E xác định và tính chất đặc trƣng của dòng chảy điện thẩm thấu, trong sự phụ thuộc vào điện tích và kích thƣớc của nó.
Thế tạo ra từ điện trƣờng E đặt vào hai đầu ống mao quản là rất lớn, thƣờng từ 10kV đến 30kV. Chính nó là động lực làm cho các phân tử chất tan di chuyển theo một hƣớng nhất định. Các chất khác nhau có điện tích và độ lớn khác nhau, sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau, do đó mà tạo sự tách sắc ký các chất phân tích. Do từ trƣờng điện thế cao mà làm cho tốc độ phân tích nhanh, số đĩa hiệu dụng lớn, hiệu suất tách cao.
Cột tách sắc ký (ống mao quản) thƣờng có độ dài từ 25cm đến 100cm, đƣờng kính trong (ID) là 25 µm đến 100 µm. Song loại đƣờng kính trong từ 50µm đến 75µm là thích hợp nhất. Vì hiệu ứng nhiệt nhỏ để khống chế nhiệt độ cho mao quản. Mao quản đƣợc chế tạo từ thuỷ tinh Silica, có phủ lớp polyme bên ngoài để làm cho ống mao quản mềm mại. Mao quản cũng có thể làm bằng polyme nhƣng loại này dễ dãn nở. Vì thế, trong thực tế ngƣời ta dùng mao quản bằng thuỷ tinh là chính. Mao quản cũng có thể đƣợc nhồi các chất sắc ký của pha tĩnh loại pha thƣờng hoặc pha ngƣợc, nhƣng có đƣờng kính nhỏ (3µm đến 5µm). trong kỹ thuật CEC, pha ngƣợc đƣợc dùng là chủ
yếu, nhƣ loại có gốc alkyl C8, C18, hay nhân phenyl. Số đĩa lý thuyết trong cột tách CEC là khá lớn từ 104
đến 105 đĩa. Sự phát hiện các chất trong quá trình tách sắc ký điện di tuỳ thuộc vào bản chất của các chất phân tích. Nói chung, là dựa trên cơ sở các tính chất: Hấp thụ quang của chất, sự phát hoặc tắt huỳnh quang của chất, tính chất điện hố của chất…
Nguyên tắc của việc định lƣợng hay phát hiện các chất cũng là trên cơ sở của mối quan hệ tín hiệu đo của chất phân tích với nồng độ của nó theo biểu thức:
H = koCx (15)
Quá trình này cũng nhờ các loại detector nhƣ trong kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao nhƣ: Detector UV-VIS, detetor huỳnh quang, detector đo độ dẫn, deteror khối phổ…
2. Sự điện di và sắc ký điện di mao quản hiệu suất cao
Sự tách các chất bằng điện di là dựa trên cơ sở tốc độ di chuyển khác nhau của các chất (các ion) cần tách trong ống mao quản trên nền dung dịch đệm pH và chất điện giải phù hợp, dƣới tác dụng của từ trƣờng E thích hợp. Tốc độ di chuyển của các chất (các ion) phân tích đƣợc tính theo biểu thức sau:
vi = µiE (16)
Trong đó:
-vi: Tốc độ di chuyển của ion chất tan i trong ống mao quản. -µi: Độ điện di của ion chất tan.
-E: Từ trƣờng điện đặt vào hai đầu ống mao quản.
Từ trƣờng điện E phụ thuộc vào điện thế đặt vào hai đầu ống mao quản và đƣợc tính theo vol/cm chiều dài. Trong thực tế của kỹ thuật CEC, điện thế này thƣờng trong vùng từ 200V/cm đến 600V/cm. Trong các điều kiện nhất định, thì độ di động điện di µion (electrophoresis mobility) gọi ngắn gọn là độ điện di của mỗi phẩn tử chất tan (ion chất tan) là một hằng số đặc trƣng. Độ điện di này đƣợc xác định bởi lực của điện trƣờng E đặt vào hai đầu ống mao quản tác động lên các phần tử đó. Song lực này tối thiểu phải bằng và thắng đƣợc lực cản của mao quản. Nghĩa là giá trị µe phụ thuộc vào tỉ số:
µe =f( FE/Ff) (17)
Trong đó:
FE : Lực điện di (Electrophoresis Force), và Ff : Lực cản trở (Frictional Force).
Và trong các định luật về điện, chúng ta có: Lực điện gây ra chuyển động của chất trong mao quản:
FE = q.E (18)
Và lực cản của mao quản là;
Trong đó:
-q: Diện tích của ion. -ri: Bán kính của ion i.
-vi: Tốc độ di chuyển của ion i.
-η: Độ nhớt của dung dịch trong ống mao quản.
Khi cân bằng thi hai lực FE và Ff này là bằng nhau, nhƣng ngƣợc chiều nhau (tức là trái dấu nhau), theo quy ƣớc, lực di chuyển EE là dƣơng, lực Ff là âm. Do đó ta có:
q.E = 6πηrivi (20)
Nhƣ thế từ biểu thức (16) và (20) chúng ta tìm đƣợc giá trị μe là:
μi = q/6πηri (21)
Mặt khác theo Stockes và Like thì chúng ta lại có:
μi = (Z.e)/( 6πηNri) (22)
Với Z là hố trị và e là điện tích của ion, N là số Avogadro. Biểu thức (21) cho ta thấy độ lớn của đại lƣợng μe phụ thuộc:
- Tỷ lệ thuận với điện tích của chất phân tích (các ion). - Tỷ lệ nghịch với:
+ Độ nhớt của dung dịch đệm điện di η.
+ Độ lớn (bán kính ri) của ion chất phân tích và 6π.
Nghĩa là trong một điện trƣờng E nhất định, thì phân tử nào có điện tích lớn và kích thƣớc nhỏ thi sẽ di chuyển nhanh. Các ion có cùng điện tích, thì ion nào có kích thƣớc nhỏ thì di chuyển nhanh hơn. Các ion có cùng bán kính, thì ion nào có điện tích lớn thì di chuyển nhanh hơn.
Độ điện di μe của các chất đƣợc xác định bằng thực nghiệm trong các điều kiện chuẩn và phần lớn đã đƣợc chỉ ra trong các sách về các hằng số hoá lý của các chất đó là giá trị μe chuẩn tuyệt đối, đƣợc ký hiệu là μeo
. Nhƣng trong thực tế của các dung dịch thực trong ống mao quản của các hệ CEC, thì khơng phải là trong các điều kiện chuẩn và chỉ duy nhất một chất nghiên cứu. Nên ngƣời ta phải xác định và thêm vào khái niệm độ điện di hiệu lực μef