C hương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.3. Phương pháp nghiên cứu:
2.3.3. Tổng hợp cDNA
cDNA được tổng hợp từ mẫu RN A tổng số virus cúm A/H5N1 (A /chicken/hatay/2004(H 5N l) do Phòng vi sinh vật phân tử tách chiết và bảo quản
ở -70°c bằng bộ kit su p erscrip t™ (Invitrogen) sử dụng mồi Oligo dT với trình tự
5 ’-CTG TG A A TG CTG CG A CTA CG A TTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 ’. Thành phần phản ứng và điều kiện tổng hợp cDNA như sau: 5,0 |xl RNA tinh sạch, 4,5^1 o f nước đã loại RNase, 3,0 (J.1 dNTPs (2,5 mM mỗi loại), 2,0 ^1 o f mồi oligo dT (200
TM
pM /ụl), 1,0 H-1 Superscript II RNase H -reverse transcriptase (200Ư/|il), 0,5 |il RN ase inhibitor (1 ou/jj.1) và 4,0 |il o f 5x first strand buffer. Phản ứng tổng hợp
Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thị Như Hoa
sự trao đổi chéo trình tự tương đồng giữa pBluBac4.5/V 5-H is-TO PO và DNA của baculovirus để tạo ra bộ khung của baculovirus tái tổ hợp.
Hình 2.2: Sơ đồ minh họa dự kiến vector tái tổ hợp pBluBacHA mang hộp gen HA. Hộp gen được chèn vào vector tại 2 vị trí Bam H I và Hind III, nằm giữa gen lacZ và ORF 1629
2.3.6. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E .coli
Cơ chế biến nạp bao gồm việc làm thay đổi cấu trúc thành tế bào vi khuẩn để DNA plasm id dễ dàng chui vào tế bào thể nhận. Những tế bào có khả năng tiếp nhận DNA- plasm id ngoại lai được gọi là tế bào khả biến. Quá trình biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli gồm 2 giai đoạn:
Tạo tế bào khả biến:
■ Tế bào E.coli được nuôi qua đêm trong 5ml mơi trường LB lỏng. ■ Pha lỗng huyền dịch tế bào đã nuôi cấy theo tỷ lệ 1:100 trong 5 ml môi trường LB.
■ Nuôi lắc ở 37°c, 200v/phút. Sau 2 giờ tiến hành kiểm tra mật độ tế
bào bằng phương pháp quang phổ kế ở bước sóng 600nm. Khi giá trị O D600 đạt từ 0,6 - 1 là đạt yêu cầu.
■ Chuyển lm l dịch tế bào sang ống eppendorf vô trùng.
■ Để trên đá 10 phút. Sau đó ly tâm thu sinh khối ở 4°c, tốc độ 4.000v/phút, trong thời gian 10 phút; loại dịch nổi.
PpH 7- 95 PBTL 6334-6635 B«nH I 138 (1) Í t 5 2 2 1 - 6 3 3 3 \ L s e q u e n c e 144 - 1 50 HA/Hatay/2004/H5N1 151-1788 r'Hind III 1789 (11 1 V5 epitope 1802-1844 6xHiê tag 1854-1872 SV40pA 1697-2024 3'and of ORF1629 2159-3037
Luận văn thạc s ĩ sinh học
_ i • • Đào Thị N hu Hoa
■ Rửa cặn tế bào bằng CaCl2 lOOmM (tỷ lệ 1:10) ở 4 ° c . Ly tâm 4.000v/phút, loại dịch nổi.
■ Rửa lại bằng CaCl2 lOOmM ( tỷ lệ 1:20) ở 4°C; ly tâm thu cặn.
■ Hòa cặn tế bào thành huyền dịch trong lOO^il CaCl2 lOOmM, giữ trong đá ít nhất 1 giờ trước khi tiến hành biến nạp.
Biến nạp:
■ Bổ sung 3-4fj.l DNA plasm id vào ống tế bào khả biến. ■ Để trên đá trong 30 phút.
■ Sốc nhiệt ờ 4 2 ° c trong lp h ú t 30 giây.
■ Chuyển ống tế bào vào trong đá xốp để 3 phút.
■ Bổ sung 250^1 môi trường LB lỏng; nuôi lắc ở 3 7 °c trong 1 giờ. ■ Cấy trải 100|il-150jxl trên môi trường thạch LBA (môi trường LB đặc có bổ sung A m p(100ng/m l)).
■ ủ đĩa đã cấy trong tủ ấm 3 7 ° c qua đêm.
2.3.7. Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E .coli
Để thu nhận plasm id tái tổ hợp, D NA plasm id được tách chiết lại từ tế bào vi khuẩn đã biến nạp và kiểm tra bằng cách cắt với enzym giới hạn. Quá trình tách chiết gồm các bước cơ bản: phá màng; loại protein; tủa nucleic acid.
■ Cấy các khuẩn lạc trắng và khuẩn lạc xanh vào 2ml môi trường LBA. N uôi lắc qua đêm ở 3 7 °c , 200v/phút
■ Ly tâm hỗn hợp dịch tế bào đã biến nạp 12.000v/p trong 1 phút; loại dịch nổi và thu cặn
■ Bổ sung Sol I (Tris-HCl 50mM, pH 8,0 + ED TA lOmM, pH8,0) và trộn đều bằng máy vortex
■ Bổ sung Sol II (NaOH 200m M + SDS 1 %), đảo nhẹ bằng tay
■ Bổ sung Sol III (K ac-Potasium A cetat 3M, pH 5,5), đào nhẹ bằng tay ■ Chiết bằng chloroform : isom ylalcohol (24:1); đảo nhẹ
Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thị N hư Hoa
■ Thu dịch nổi, tủa bằng muối N A O A C 3M (1/10 thể tích) và Ethanol 100% (2,5 thể tích) ở -2 0 °c ít nhất trong 1 giờ
■ Ly tâm 12.000v/phút trong 20 phút; loại bỏ dịch nổi thu cặn ■ Rửa cặn bàng Ethanol 70%
■ Làm khô cặn và hòa tan lại trong dung dịch TE-RNase (100ng/m l) ■ ủ trong bể ổn nhiệt 3 7 °c trong 1 giờ để loại RNA
■ Điện di kiểm tra trên gel agarose 1 %.
2.3.8. Kiểm tra DNA plasmid bằng enzym giới hạn
Trong quy trình, chúng tơi tiến hành phương pháp này nhằm kiểm tra vector pCR2.1 và dòng plasm id pBluBac4.5/V 5-H is-TO PO có m ang hộp gen HA hay
không. V ector p C R /k í tái tổ hợp mang hộp gen HA được chọn lọc bằng cách cắt kiểm tra với 2 enzym là BamH I và Hind III.
Phản ứng cắt vector biểu hiện tái tổ hợp với enzym giới hạn gồm:
H 20 khử ion vô trùng : 3,5 ụl
D ung dịch đệm cho enzym (buffer 3) : 1,0 (J.1
B S A : 0,1 ịi\
Enzym giới hạn (£cơR I; B am ìỉ I; Xho I) : 0,4 |il
D N A plasmid_______________________________ : 5,0 Ịil
Tổng thể tích : 10 |al
Hỗn hợp phản ứng được trộn đều, ủ ở nhiệt độ 3 7 °c trong 4 giờ. Sản phẩm
phản ứng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Trình tự và cấu trúc và hộp gen HA trong pCR H A và pBluBacH A sau khi cắt kiểm tra bằng enzym cắt giới
hạn được khẳng định lại bằng đọc trình tự DNA nhờ hệ thống đọc trình tự tự động ABI PR ISM ® 3100. Các dòng plam id tái tổ hợp mang gen HA được tách lượng lớn và bảo quản ở -20°c để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.3.9. Thu đoạn DNA từ gel agarose
Đe thu đoạn DNA từ gel agarose, chúng tôi sử dụng bộ sinh phẩm kit Bioneer. Q uá trình này gồm các bước cơ bản:
Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thị N hư Hoa
■ Lấy mẫu chạy điện di trên gel agarose 1% cùng loading dye
■ Thu băng DNA cần quan tâm: đưa bản gel lên soi trên tia cực tím, cắt băng DNA mong muốn, đưa vào ống eppendorp cân xác định trọng lượng^ bổ sung dung dịch thôi gel theo tỷ lệ 1:1
■ ủ ở nhiệt độ 55 0 c trong 10 phút, đảo nhẹ cho gel tan hoàn toàn. ■ Li tâm 1000 vòng / phút
■ Gẳn DNA lên cột ■ Đẩy DNA ra khỏi cột.
2.3.10. Chọn lọc các dòng plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO mang hộp gen HA
V ector pBluBacH A tái tổ hợp m ang hộp gen HA được chọn lọc bằng cách cắt kiểm tra với 2 enzyme là BamH I và Hind III. Trình tự và cấu trúc và hộp gen
HA trong pBluB acH A sau khi cắt kiểm tra bằng enzyme cắt giới hạn được khẳng định lại bàng đọc trình tự D NA nhờ hệ thống đọc trẽnh tự tự động ABI PRISM ® 3100 (A pplied Biosystems, Mỹ). Các dnng plam id tái tổ hợp m ang gen HA được tách lượng lớn và bảo quản ở -20°c để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.3.11. Chuẩn bị tế bào Sf9 cho quá trình đồng chuyền nạp
- Tế bào Sf9 được bảo quản trong nitơ lỏng. Trước khi nuôi cấy khoảng 30 phút, làm ấm môi trường nuôi cấy (grace insect cell m edium +10% FBS) ở nhiệt độ phòng hoặc ủ trong bể nước 37°c. Lấy tế bào ra khỏi bình nitơ lỏng và làm tan nhanh bằng cách ủ ở bể nước 3 7 °c trong vòng 5 phút. Các bước tiếp theo được tiến hành trong tủ cấy vô trùng.
- H út 5-10 ml môi trường nuôi cấy vào ống falcon 15 ml, dùng pipet vô trùng hút toàn bộ dịch tế bào SÍ9 đã làm tan băng cho vào ống môi trường đã chuẩn bị này.
- Ly tâm ở tốc độ 1.000 vòng/phút trong thời gian 5 phút ở 20°c. Hút bỏ dịch nổi, bổ sung 15 ml môi trường nuôi cấy mới vào, nhẹ nhàng làm tan tế bào bằng pipet.
Luận văn thạc s ĩ sinh học• ___ ___ • Ị Đào Thị N hu Hoa
- Chuyển tồn bộ mơi trường chứa tế bào Sf9 này vào chai nuôi cấy tế bào T- 75 cm 2.
- Tháo lỏng nắp chai nuôi cậy, ủ tế bào trong tủ nuôi cấy vô trùng đã đặt nhiệt độ ở 28°c.
- Sau 2 ngày nuôi cấy, dùng pipet hút bỏ môi trường nuôi cấy và bổ sung 10 ml môi trường nuôi cấy mới đã làm ấm ở nhiệt độ phòng.
- Tiếp tục nuôi cấy cho đến khi m ật độ tế bào (cell confluence) đạt khoảng 90% thì cấy chuyển nhân dịng tế bào.
2.3.12. Đồng chuyển nạp
Để tạo các VLP biểu hiện protein HA của virus cúm A/H5N1 trong tế bào côn trùng Sf9, chúng tôi tiến hành đồng chuyển nạp baculovirus transfer vector mang gen HA và DNA của baculovirus vào tế bào SÍ9. Các bước tiến hành như sau:
TM _
- H út 10 |il (0.5 Hg) D NA của baculovirus (Bac-N-Blue DNA) vào ông eppendorf 1.5 ml vô trùng, sau đó cho tiếp 4 ^1 baculovirus transfer vector m ang gen HA vào ống và trộn nhẹ nhàng bằng pipet 1-2 lần.
- Bổ sung lm l môi trường nuôi cấy (G race’s insect medium ) khơng có FBS.
7 , R ,
- Bơ sung 20 |J.1 hóa chât Cellfectin vào ơng.
- Trộn đều hỗn hợp chuyển nạp bằng pipet khoảng 2-3 lần, để hỗn hợp ở nhiệt độ phịng khoảng 5-10 phút.
- Chuyển tồn bộ hỗn hơp chuyển nạp vào đĩa tế bào Sf9 đã chuẩn bị ở trên bằng cách nhỏ từng giọt m ột vào đĩa, lắc nhẹ đĩa bằng tay 2-3 lần cho hỗn hợp trải đều trên toàn bộ bề m ặt đĩa tế bào.
- Chuyển đĩa tế bào đã được chuyển vảo tủ nuôi cấy 28°c.
- Ba ngày (72 giờ) sau khi chuyển nạp, quan sát sự hình thành các CPE (cytopathic effect), nếu đạt 60-70% thì tiến hành thu virus.
- D ùng pipet làm bong các tế bào còn bám dính trên bề mặt đĩa ni cấy, thu tồn bộ dịch tế bào m ang virus và cất giữ ở 4°c .
Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thi N hư Hoa
2.3.13. Tách chiêt DNA tông sô từ baculovirus tái tô họp
R
D NA được tách chiêt băng kit tinh sạch DNA W izard plus s v minipreps (Prom ega). Các bước được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Mô tả ngắn gọn, 0,5 ml dịch nuôi cấy tế bào Sf9 lây nhiễm baculovirus tái tổ hợp được hòa tan trong 250 JJ.1 dịch hòa tan tế bào (resuspension solution). Bổ sung tiếp 250 |il dung dịch phá tế bào, 10 nl alkaline protease và 350 fil dung dịch trung hòa. Hỗn hợp sau đó được đào đều nhẹ nhàng và ly tâm ở tốc độ 13,000 vòng/phút trong 10 phút. Hút dịch nổi phía trên đưa sang cột tinh sạch và ly tâm 13,000 vòng/phút trong 1 phút. Rửa cột bằng 750 |il đệm rửa. Cuối cùng, D N A bám trên cột được đẩy ra khỏi cột bàng 80 |il nước khủ ion vô trùng và được sử dụng là khuôn cho phản ứng PCR để kiểm tra sự có mặt của gen HA trong tế bào côn trùng.
2.3.14. K iểm tra sự có mặt gen HA trong tế bào côn trùng Sf9 bằng PCR
Chúng tôi sử dụng cặp mồi đùng để tách dòng và thiết kế vector baculovirus tru n g gian mang hộp gen HA để kiểm tra sự có m ặt gen nghiên cứu trong tế bào côn trùng Sf9. Cặp mồi cho gen HA có trình tự tương ứng như sau:
H A pB ac-F: 5’- ACG G GA TCC G G T CAT G GA GAA AAT A G T GCT TC - 3 ’ H A pB ac-R : 5’ - TCG G AA GCT TG A TTG CC A GAG CTA GGG - 3 ’.
Phản ứng PCR được tiến hành trong tổng thể tích 25 nl bao gồm: 50 ng DNA tổ n g số được tách ở trên, 2,5 |il đệm phản ứng 10X, dNTP mỗi loại 0,25 mM, 1 pm ol mồi mỗi loại, 1 đơn vị DNA Dream®7a<7 polymerase của hãng Fermentas. C hương trình PCR được tiến hành theo các bước: 94°c trong 3 phút; 94°c trong 30 giây; 60°c trong 30 giây; 72°c trong 1,5 phút (35 chu kỳ lặp lại từ bước 2); 72°c
tro n g 8 phút và giữ ở 4 °c cho đến khi phân tích. Sản phẩm PCR (gen HA) được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose.
Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thị N hư Hoa
CH Ư Ơ NG 3: KÉT QUẢ VÀ TH Ả O LUẬN
3.1. Thiết kế DNA bộ khung của baculovỉrus tái tổ hợp mang hộp gen HA 3.1.1. T hiết kế hộp gen HA
cDNA tử virus cúm A/H5N1 được dùng làm khuôn, sử dụng cặp mồi HapBAc-F - HapBac-R để khuếch đại gen HA. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng
điện di trên gel agarose 1% (Hình 3.1). Sản phẩm PCR (hộp gen HA) này theo lý thuyết là gen HA gán thêm vị trí nhận biết của enzym e BamH I, trình tự Koraz, mã khởi đầu tại đầu 5 ’; vị trí nhận biết của Hind III và mã kết thúc tại đầu 3 ’, đây là các thành phần thiết yếu cho quá trình biểu hiện của gen trong tế bào Eukaryote. Kết
quả điện di cho thấy có m ột băng DNA với kích thước khoảng 1.6 kb, tương đương với kích thước hộp gen HA do chúng tơi thiết kế theo tính tốn dài 1664 bp. N hư vậy, có thể kết luận hộp gen HA của virus cúm A /H 5N 1 đã được khuếch đại đặc hiệu.
1 2
Hình 3.1: Điện di sản phẩm PCR nhân gen H A bằng cặp mồi (HApBac-F và H A pB ac-R ) trên gel agarose 1%. 1: thang D N A 1 kb chuẩn (Ferm entas, Đức); 2:
sản phẩm PCR.
3.1.2. Tách dòng hộp gen HA vào vector pCR2.1
Trước khi thiết kế vào vectơ trung gian baculovirus, hộp gen HA được tách dòng vào vectơ pCR2.1 (Invitrogen, M ỹ). Các bước tiến hành được mô tả ngắn gọn như sau: sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được gắn trực tiếp vào vector pCR2.1, biến nạp vào tế bào E. coli (D H 5a) và nuôi cấy trên môi trường LB chọn lọc có bổ sung A m picilin (100 ng/m l), IPTG (lm M ) và X-gal (100 |ig/m l). Chúng tôi chọn
Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thị N hư Hoa
ngẫu nhiên 6 khuẩn lạc trắng và 1 khuẩn lạc xanh để tách plasm id và chọn các plasm id m ang hộp gen HA bằng cách cắt với hai enzym e cắt giới hạn Bamtì I và Hiná III. Sản phẩm phân cắt sau đó được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết
quả kiểm tra bằng điện di (Hình 3.2) cho thấy, 5 trong 6 dòng plasm id tái tổ hợp chọn lọc có khả năng mang gen H5 (tương ứng với đường chạy 10 đến 14, Hình
3.2B).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
3000 bD—J
1500 bD—► -1700 bD
B
Hình 3.2: Chọn lọc các dòng plasm id pCR2.1 tái tổ hợp mang hộp gen HA bằng điện di trên gel agarose 1%. A: DNA plasm id tách từ các khuẩn lạc trắng (1-6) và khuẩn lạc xanh (7); B: DNA plasm id pCR2.1 tái tổ hợp được xử lý bằng hai enzyme hạn chế BamH I và Hinà III, thang DNA chuẩn 1 kb (8), plasm id tái tổ hợp từ
khuẩn lạc xanh (9) và khuẩn lạc trắng (10-14) cắt bằng BamH I và Hind III; đối
chứng: sản phẩm PCR gen HA (15).
C húng tôi chọn DNA plasm id từ các khuẩn lạc số 5 và số 6 (Hình 3.2A), tương ứng với đường chạy số 13, 14 (Hình 3.2B), để phân tích tiếp bàng xác định trình tự nhằm khẳng định chắc chắn trình tự và cấu trúc hộp gen HA trong vectơ pCR2.1 tái tổ hợp. K ết quả đọc trình tự (khơng nêu ở đây) cho thấy trình tự nucleotide của gen HA trong vectơ pCR2.1 tái tổ hợp tương đồng 100% với trình tự của gen này đã được chúng tơi tách dịng trước đây và có thêm trình tự nhận biết của enzym e cắt giới hạn, trình tự Kozak, m ã khởi đầu và mã kết thúc. Plasmid pCR2.1 m ang gen HA của virus cúm A/H5N1 được ký hiệu là pCRHA.
Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thị N hư Hoa
3.1.3. Thiết kế vector trung gian baculovirus mang hộp gen HA
Vector pCRHA và vector pBluBac4.5/V 5-H is-TO PO được xử lý đồng thời bang BamW I và Hind III, phân tách sản phẩm cắt trên gel agarose 1% sau đó cắt
riêng biệt từng vùng gel chứa DNA hộp gen HA và DNA bộ khung vector m ở vòng, tinh sạch và thu lại các sản phẩm cắt bằng kit thôi gel của Fermentas (Đức). Sản phẩm phân cắt sau khi tinh sạch và thu nhận bằng kit thôi gel, được kiểm tra lại bằng điện di trên gel agarose 1%. Kết quả điện di cho thấy, một băng có kích thước khoảng 1600 bp (hộp gen HA) và m ột băng có kích thước khoảng 5000 bp (vectơ pBluBac4.5/V 5-H is-TO PO ) ở các đường chạy tương ứng (Hình 3.3). Kết quả này chứng tỏ hộp gen HA và bộ khung vector pBluBac4.5/V 5-H is-TO PO sau khi cắt bằng BamH I và Hind III đã được tinh sạch và thu nhận.
1 2 3
5000 bp 1500 bp
Hình 3.3: Gen HA từ vectơ tách dòng pCR H A và vectơ pBluBac4.5/V 5-H is-TO PO được thu nhận lại từ gel agarose 1% sau khi xử lý bằng BamH I và Hind III.