(Ban hành kèm theo Thông tư 27/2012/TT-BYT ngày 30 tháng 11 năm 2012 của Bộ trưởng Bộ Y Tế).
ST
T Nhóm thực phẩm Giới hạn tối đa trong thực phẩm (mg/kg)
TT Ama In PR SY Allu FG Car Ery Bri 1 Đồ uống từ sữa, có hương liệu hoặc lên men 300 - 300 150 300 300 100 - - 150
2 Sữa lên men (nguyên chất) 300 300 100 150 300 300 100 150 300 150
3 Quả đóng hộp hoặc đóng chai (đã thanh trùng) 200 - - 300 50 200 200 - - 200 4 Rau, củ (bao gồm nấm, rễ, thực vật thân củ và thân rễ, đậu, đỗ, lô
hội) tảo biển ngâm trong dấm, dầu, nước muối hoặc nước tương 300 200 150 - 30 300 300 - 30 500 5 Rau đóng hộp, đóng chai (đã thanh trùng) hoặc đóng túi (bao gồm
nấm, rễ, thực vật thân củ và thân rễ, đậu, đỗ, lô hội) và tảo biển 100 - 300 - GMP 200 200 GMP - 200 6 Mỳ ống, mì dẹt đã được làm chín và các sản phẩm tương tự 300 100 - - 300 - 290 GMP - 100
7 Cá, sản phẩm thủy sản lên men hoặc đóng hộp, kể cả nhuyễn
thể, giáp xác, da gai đóng hộp được bảo quản hoàn toàn 30 30 - 500 300 - 100 - - 500 8 Nước chấm không ở dạng nhũ tương (VD: tương cà chua,
tương ớt, sốt kem, nước thịt) 100 - - 50 300 300 100 - - 100
9 Viên xúp và nước thịt 50 - 50 50 50 50 - 50 50 50
Ghi chú: Các giá trị ” –” là các sản phẩm không chứa phẩm màu.
”GMP” – là thực hành sản xuất tốt (Good Manufacturing Practices - GMP)
1.4. Các phƣơng pháp xác định phẩm màu
1.4.1. Phƣơng pháp định tính xác định phẩm màu không đƣợc phép sử dụng
Các phẩm màu thuộc nhóm phẩm dẫn xuất từ than đá có tính axit: được phép sử dụng trong chế biến thực phẩm.
Những chất phẩm thuộc nhóm dẫn xuất từ than đá có tính kiềm: đều độc hại, có khả năng gây ung thư nên không được phép dùng trong chế biến thực phẩm. Do đó, có thể căn cứ vào tính axit hay tính kiềm làm đặc điểm nhận dạng phẩm được phép sử dụng hay không. Phương pháp được tiến hành cụ thể như sau:
Làm nhiều bộ, mỗi bộ gồm 3 ống nghiệm 10 ml có nút vặn bằng nhựa trong đó: cho vào ống 1: 5ml nước hoặc cồn 75 độ, và 5 giọt NH4OH, cho vào ống 2:3-5 ml ete etylic và 5 giọt NH4OH đặc; cho vào ống 3: 3-5 ml axit axetic 5%. Mỗi mẫu ta dùng một bộ như trên và thao tác như sau: Phẩm mẫu dầm nhỏ cho vào ống 1, đậy nắp lắc kỹ, để yên. Gạn nước ống 1 vào ống 2. Để yên. Gạn lớp ete bên trên ống 2 sang ống 3, lắc đều, để yên quan sát, đánh giá: nếu dung dịch axit acetic bên dưới có màu: phẩm có tính kiềm, khơng được phép sử dụng. Dung dịch axit axetic bên dưới không có màu: phẩm được phép sử dụng.
1.4.2. Phƣơng pháp xác định các phẩm màu đƣợc phép sử dụng trong thực phẩm
Trên thế giới, việc xác định hàm lượng các phẩm màu nói chung và phẩm màu trong thực phẩm nói riêng là vấn đề đang rất được quan tâm. Các phương pháp truyền thống làm phẩm màu như sắc ký giấy , sắc ký bản mỏng , chiết tách sử du ̣ng len lông cừu…Nhiều nhà khoa học tiến hành nghiên cứu xác định các phẩm màu này bằng nhiều phương pháp khác nhau trên các đối tượng như bánh, kẹo, nước giải khát, thịt, cá…Dưới đây là một số phương pháp phổ biến đã được tiến hành thực nghiệm.
1.4.2.1. Phương pháp trắc quang
Phân tích trắc quang là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất trong các phương pháp phân tích hố lý. Đây là phương pháp đơn giản, ít tốn kém và dễ thực hiện. Phương pháp chỉ phù hợp để xác định đơn lẻ từng phẩm màu hoặc các phẩm màu có bước sóng hấp thụ xa nhau. Khi phân tích đồng thời nhiều phẩm màu đặc biệt
những phẩm màu có bước sóng hấp thụ gần nhau dễ gây sai số do hiện tượng chồng phổ làm cho độ hấp thụ tăng lên.
Tác giả L.F. Capitán-Vallvey và cộng sự [21] đã phát triển phương pháp trắc quang sử dụng thuật toán hồi quy đa biến để xác định đồng thời các chất màu tartrazine, ponceau 4R và vàng FCF trong thực phẩm. Các chất màu được cố định trên gel Sephadex DEAE A-25 ở pH 2.0. Đo phổ hấp thụ quang của các chất trong khoảng bước sóng 400- 800 nm so với mẫu trắng và định lượng bằng phương pháp đường chuẩn. Khoảng tuyến tính cho cả 3 chất màu là 50,0-650,0 ng/ml. Kết quả thực nghiệm cho độ lệch chuẩn là 5,5267 cho SY, 6,3878 cho TT và 6,9816 cho PR. Hệ số tương quan tuyến tính là 0,9977, 0,9978 và 0,9954 cho SY, TT và PR. Phương pháp này được ứng dụng để xác định các chất màu trong thực phẩm và kết quả được so sánh với phương pháp HPLC. Trong hầu hết các trường hợp (8/9 mẫu) kết quả của 2 phương pháp là tương đương nhau.
1.4.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
Tác giả Stefania Bonan và cộng sự [28] đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng với detector UV để xác định đồng thời 17 phẩm màu tổng hợp trong mẫu thực phẩm rắn và đồ uống, bao gồm azorubine (E122), amaranth (E123), cochineal red A (E124), red 2G (E128), allura red (E129), azocarmine B (AZO B), azocarmine G (AZO G), ponceau 2R (P2R), ponceau 6R (P6R), tartrazine (E102), sunset yellow (E110), quinoline yellow (E104), orange II (OR II), metanil yellow (MY), patent blue V (E131), indigo carmine (E132) and brilliant blue FCF (E133). Các mẫu rắn được chiết trong hỗn hợp nước-rượu, làm sạch trên cột chiết pha rắn SPE polyamide và rửa giải bằng dung dịch methanol. Các mẫu đồ uống dạng lỏng được pha loãng và lọc. Phương pháp đã được thẩm định độ chính xác (độ đúng và độ chụm), độ đặc hiệu theo quy định (2004/ 882/ CE) và được áp dụng cho khoảng nồng độ từ 5 đến 300 mg/ kg với mẫu rắn và 5-100 mg/ l cho đồ uống phụ thuộc vào từng chất.
Tác giả Simone Pereira Alvesa và cộng sự [27] đã phát triển và áp dụng phương pháp để xác định 5 phẩm màu tổng hợp (Sunset Yellow, tartrazine, Amaranth, Brilliant Blue và Red-40) trong ba loại thực phẩm khác nhau: bột nước cốt rắn, bột thạch rắn và
nước giải khát sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV-DAD. Quá trình sắc ký được khảo sát sử dụng một cột ODS Zorbax (250 mm, 4,6 mm, 5 mm) và hai hệ thống dung môi khác nhau. Chuẩn bị mẫu bao gồm hòa tan và lọc các mẫu. Phương pháp có giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng phù hợp và hiệu suất thu hồi cao (> 98,8%). Tất cả các mẫu nghiên cứu cho thấy nồng độ phẩm màu phù hợp với quy định của Brazil.
Tác giả Katerina S. Miniotia và cộng sự [22]đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng pha đảo để tách thành công 13 màu thực phẩm tổng hợp (Tartrazine E 102, E 104 Quinoline vàng, Sunset Yellow E110, Carmoisine E122, Amaranth E123, Ponceau 4R E124, Erythrosin E127, Red 2G E128, Allura Red AC E129, xanh ve E131, Indigo Carmine E132, Brilliant Blue FCF E133 và Green SE E142). Pha tĩnh sử dụng cột C18 và pha động chứa hỗn hợp acetonitrile-methanol với tỉ lệ (20:80 v/v) và 1% (m/v) đệm ammonium acetate ở pH 7,5. Quá trình rửa giải gradient đã được tối ưu để tách thành công các chất trong vòng 29 phút. Định lượng các chất màu ở bước sóng 350- 800 nm. Phương pháp đã được thẩm định các thông số. Giới hạn phát hiện của các chất trong khoảng 1,59 Green SE (E142) và 22,1 Ponceau 4R (E124) mg/L. Độ chụm trong ngày (RSDr) dao động từ 0,37% ( Camoisine E122 trong trái cây uống có hương vị ở nồng độ 100 mg/L) lên 4,8% (Green SE E142 đường ở mức 0,9 mg/ kg). Độ chụm giữa các ngày (RSDR) là giữa 0,86% cho camoisine E122 trong trái cây có hương vị thức uống tại 100 mg/L và 10% cho green SE E142 trong mứt ở nồng độ 9 mg/kg. Độ thu hồi cao từ 94% (E142 trong mứt) đến 102% (E131 trong đồ ngọt). Phương pháp này được áp dụng cho việc xác định các chất màu trong nhiều loại thực phẩm hòa tan trong nước, như trái cây hương vị thức uống, đồ uống có cồn, mứt, bánh kẹo đường và đồ ngọt.
Tác giả N. Yoshioka và cộng sự [29] đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng pha liên kết pha đảo với mảng phát hiện photodiode để xác định thành công 40 phẩm màu tổng hợp. Các phẩm màu được phân tích trong vịng 19 phút sử dụng một cột phân tích ngắn (50mm×4.6mm, 1.8mm) ở 50°C với gradient rửa giải: Ponceau 6R, Tartrazine, Fast vàng AB, Amaranth, Indigotin, Naphthol vàng S, Chrysoine, Ponceau 4R, Sunset Yellow FCF , đỏ 10B, Orange G, Acid violet 7, Brilliant đen PN, Allura red AC, Yellow
2G, Red 2G, Uranine, Fast E đỏ, xanh S, Ponceau 2R, Azorubine, Orange I, Quinoline màu vàng, màu vàng Martius, Ponceau SX, ponceau 3R, Fast Green FCF, Eosine, Brilliant Blue FCF, Orange II, Orange RN, Acid blue 1, Erythrosin, Amido đen 10B, Acid đỏ 52, Patent xanh V, Acid xanh 9, Phloxine B, Benzyl tím 4B, và Rose Bengal. Độ thu hồi của các hợp chất này khi thêm chuẩn vào nước giải khát và bánh kẹo tại 5mg/g dao động 76,6-115,0%, và độ lệch chuẩn tương đối (RSD) là trong vòng 6,0%. Các giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng là 0,03 và 0,1 mg/g cho tất cả các chất.
Tác giả Ming Maa, b và cộng sự [24] đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối với detector khối phổ để xác định đồng thời các phẩm màu tổng hợp tan trong nước và tan trong dầu: Tartrazine, Amaranth, Ponceau 4R, Sunset Yellow FCF và Sudan (I-IV). Phương pháp này sử dụng Dimethylsulfoxide (DMSO) là dung mơi chiết trong q trình chuẩn bị mẫu và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) mảng – diode (PDA)-ghép khối phổ phun điện tử (ESI-MS). Giới hạn phát hiện và định lượng trong phạm vi 0,01-4 và 0,03-11,2 ng. Hiệu suất thu hồi dao động 93,2- 108,3%. Độ lệch chuẩn tương đối < 8,2%. Phương pháp này đã được ứng dụng để xác định các chất màu hòa tan trong nước trong các mẫu nước ngọt và chất màu tan trong dầu trong các mẫu bột ớt và gia vị ớt.
Tác giả G.Karanikolopoulos và cộng sự [23] đã nghiên cứu và phát triển phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao xác định đồng thời 7 phẩm trong cá và các sản phẩm từ bằng phương pháp HPLC-PDA: E100 Sunset Yellow, E122 Azorubin, E123 Amaranth, E124 Ponceau 4R, E127 Erythrosine, E128 Red 2G, E129 Allura Red AC với điều kiện chạy máy pha động gồm kênh A: Amoni acetat 0,13M (w/v) ở pH 7.5, kênh B: MeOH, kênh C: ACN. Chương trình gradien đã được tối ưu để tách thành cơng các chất trong vịng 22 phút. Sử dụng detector PDA ở bước sóng 300-700nm, cột C18 Symmetry C18(25mm × 4.6mmì5 àm), tc dũng 1.5mL/phỳt. Quỏ trỡnh x lý mẫu sử dụng 3 thí nghiệm như sau:
+ Thí nghiệm 1: chiết mẫu bằng dung dịch I (NH3:MeOH= 5:95) + 10ml H2O, sau đó điều chỉnh pH 4.5 bằng dung dịch axit HCl 6N
+ Thí nghiệm 2: chiết mẫu bằng dung dịch I (NH3:MeOH= 5:95) + 10ml H2O, sau đó điều chỉnh pH 7.0 bằng dung dịch axit HCl 6N
+ Thí nghiệm 3: chiết mẫu bằng dung dịch I (NH3:MeOH= 5:95) + 10ml amoni acetat 0.13M, điều chỉnh pH 7.0 bằng dung dịch axit HCl 6N
Hiệu suất thu hồi ở Thí nghiệm 3 là cao nhất và >90%. Độ lệch chuẩn nhỏ <10% cũng đã đạt được. Phương pháp này đã được áp dụng thành công trong việc xác định các chất màu có trong nền mẫu cá và các sản phẩm từ cá như trứng cá.
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: thực phẩm gồm bánh, kẹo, thạch, nước giải khát.
2.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
2.2.1. Hóa chất
Các loại hóa chất dùng trong phương pháp đều thuộc loại tinh khiết phân tích * Chất chuẩn
- Chuẩn sunset yellow độ tinh khiết ≥ 90% (hãng sigma aldrich) - Chuẩn erythrosin độ tinh khiết ≥ 99% (hãng sigma aldrich) - Chuẩn brilliant blue độ tinh khiết ≥ 50% (hãng sigma aldrich) - Chuẩn indigocarmin độ tinh khiết ≥ 80% (hãng sigma aldrich) - Chuẩn carmoisine độ tinh khiết ≥ 99% (hãng sigma aldrich) - Chuẩn amaranth độ tinh khiết ≥ 99% (hãng sigma aldrich) - Chuẩn fast green độ tinh khiết ≥ 99% (hãng Merck)
- Chuẩn tartrazine độ tinh khiết ≥ 85% (hãng sigma aldrich) - Chuẩn ponceau 4R độ tinh khiết ≥ 99% (hãng sigma aldrich) - Chuẩn allura red từ độ tinh khiết ≥ 99% (hãng sigma aldrich)
+ Dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm: cân khoảng 0,1g trên cân phân tích có độ chính xác 0,0001g chuẩn phẩm màu, hịa tan và định mức 100ml bằng H2O. Bảo quản trong tủ lạnh 40C, sử dụng trong 1 năm.
+ Dung dịch chuẩn trung gian (200 ppm): hút 2ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 10ml và định mức tới vạch bằng H2O
+ Các dung dịch chuẩn làm việc nồng độ 0,1; 0,5; 1,0; 5,0; 10,0; 20,0 ppm được pha trong H2O
* Các loại hóa chất, dung môi khác: - Methanol (Merck 99,9%) - MeOH - n-hexan (Merck 99,9%)
- Ethanol (Merck 99,9%) -EtOH - Petroleum ete (Merck 99,9%)
- Natri hydrophotphate (Merck 99,9%) – NaH2PO4 - Amoni axetat (Merck 99,9%) – CH3COONH4
- Nước cất dùng cho sắc ký lỏng: nước cất hai lần lọc qua bộ lọc màng 0,45µm sau đó rung siêu âm.
- Chuẩn bị pha động: Kênh A là dung dịch natri hydrophotphate NaH2PO4, kênh B là MeOH, ACN
2.2.2. Thiết bị
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao của Shimadzu bao gồm: Bơm cao áp LC 20AD, bộ tiêm mẫu tự động SIL 20AHT, buồng ổn định nhiệt độ cột CTO 10ASvp, detector mảng diod aray PDA - M20A. Cột sắc ký C18 - SymmetryC18(150 mm x 4,6mm x 5μm) và tiền cột C18 (20 mm × 3,9 mm ì 5àm)
- Máy lắc vortex - Máy đồng nhất mẫu - Máy ly tâm Hermle
- Máy rung siêu âm có chế độ gia nhiệt (Elma, Germany) - Cân phân tích (có độ chính xác 0,1mg và 0,01mg) - Cân kĩ thuật (có độ chính xác 0,01g)
2.2.3. Dụng cụ
- Ống ly tâm 50ml
- Ống đong dung tích 10, 25, 50, 100ml
- Pipetman, pipet nhựa, pipet pasteur 200µl; 1000µl; 5ml…đầu cơn - Vial loại 1,8ml
- Bình định mức dung tích 5, 10, 25, 50, 100 ml - Ống nghiệm thủy tinh có nút xoáy
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
Đa số các phẩm màu trên đều thuộc nhóm chất màu monoazo trong phân tử có chứa một nhóm mang màu azo như -N = N - liên kết với các gốc thơm. Phẩm nhuộm Azo là những chất rắn, chỉ hoà tan trong nước khi trong phân tử có chứa các nhóm -SO3H, -COOH hoặc -R4N+ nên chúng là các hợp chất phân cực. Có thể sử dụng
nhiều phương pháp khác nhau để xác định phẩm màu trong thực phẩm như: phương pháp trắc quang, phương pháp HPLC kết hợp với một detector thích hợp: UV-VIS, PDA, MS…Sử dụng phương pháp trắc quang cho kết quả kém chính xác khi định lượng đồng thời nhiều phẩm màu có bước sóng hấp thụ gần nhau. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ có độ nhạy cao, nhưng thiết bị đắt tiền chưa phổ biến tại Việt Nam. Do vậy, để phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm, chúng tơi lựa chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để xác định các phẩm màu trong thực phẩm. Đây là phương pháp hiện đại, có độ tin cậy cao, có tính ứng dụng rộng rãi.
Nguyên lý: Sử dụng hỗn hợp dung môi gồm (NH3:MeOH) và CH3COONH4 để chiết phẩm màu ra khỏi nền mẫu, tiến hành rung siêu âm, ly tâm. Dịch chiết được gộp vào bình định mức 50 ml, điều chỉnh pH sau đó lọc và tiêm vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector PDA với quy trình phân tích mẫu dự kiến như sau:
* Tóm tắt quy trình dự kiến
Hình 2.1. Quy trình phân tích một số phẩm màu
Mẫu TP chứa chất béo Mẫu nguyên liệu không chứa chất béo
Loại béo Chiết lặp HPLC Cặn Gạn dịch chiết vào bình định mức 50 ml Định mức đến vạch Để nguội Lắc vortex Ly tâm 6000 vòng/phút /5 phút Lọc
Mẫu đã loại chất béo
+ Dung môi chiết
Rung siêu âm (nhiệt độ, thời gian)
+ Dung môi chiết
+ Dung môi chiết
Cân mẫu vào ống ly tâm 50ml
- Mẫu được đồng nhất kỹ
- Cân mẫu vào ống ly tâm, với nền mẫu chứa nhiều chất béo (loại chất béo trước khi phân tích)
- Thêm dung mơi chiết mẫu vào ống ly tâm trên - Lắc vortex để mẫu và dung môi được đảo trộn đều
- Rung siêu âm để tăng khả năng hịa tan của chất phân tích - Để nguội đến nhiệt độ phòng
- Ly tâm với tốc độ cao, phân tách phần dung dịch và lắng chặt phần cặn
- Phần dịch trong được gạn vào bình định mức 50 ml, phần cặn được chiết lặp