Sau khi đƣợc phân lập, từng chủng vi khuẩn đƣợc nuôi trong môi trƣờng lỏng Brucella Broth (BB) qua đêm để tăng lƣợng vi khuẩn. Ly tâm thu tế bào vi khuẩn trong điều kiện vô khuẩn 4oC để lấy sinh khối. Hòa tế bào vi khuẩn trong mơi trƣờng lỏng BB có bổ sung 30% glycerol (v/v) rồi chia vào các ống giữ giống, giữ ở -80oC.
2.3.5. Nhuộm Gram và quan sát dƣới kính hiển vi thƣờng
Vi khuẩn phết lên lam kính đƣợc cố định nhanh trên ngọn lửa đèn cồn và bằng tím kết tinh (2 g tím kết tinh trong 20 ml ethanol 95%, 0,8 g ammonium oxalate trong 80 ml nƣớc cất) trong 1 phút. Rửa tiêu bản bằng nƣớc và nhuộm tiếp bằng dung dịch Lugol (1 g Iod, 2 g KI trong 300 ml nƣớc cất) trong 1 phút. Sau khi rửa lại tiêu bản bằng nƣớc, phủ lên tiêu bản một lớp cồn 95% và rửa tiếp tiêu bản bằng nƣớc. Nhuộm bổ sung tiêu bản bằng dung dịch safranin 0,5% trong 1 phút. Rửa tiêu bản bằng nƣớc cất và xem tiêu bản dƣới kính hiển vi thƣờng có độ phóng đại 100 lần. Vi khuẩn Gram dƣơng bắt màu tím, vi khuẩn Gram âm bắt màu đỏ.
2.3.6. Test Helicotest
Mảnh sinh thiết đƣợc cho vào giếng thử, sau đó nhỏ dung dịch thử vào giếng cho ngập mảnh sinh thiết. Phản ứng thử cho kết quả sau khoảng 10-20 phút. Nếu màu của dung dịch thử chuyển từ màu vàng sang màu hồng cánh sen thì mẫu phẩm có H.
pylori.
2.3.7. Tách chiết ADN từ vi khuẩn và từ sinh thiết
ADN đƣợc tách chiết từ sinh thiết dạ dày bằng Bộ Kít QIA-gene (Blood and Tissue Kit); từ vi khuẩn dùng Bộ Kít Genomic DNA purification Kit (Fermentas). ADN đƣợc đƣợc hịa trong 100-200 µl 1x TE. Nồng độ và độ tinh sạch của chế phẩm ADN đƣợc kiểm tra trên máy NanoDrop1000, Thermo scientific.
2.3.8. Xác định HPstatus của các bệnh nhân
HPstatus của các bệnh nhân đƣợc xác định nhờ phân tích các chỉ thị phân tử của
H. pylori nhƣ gen glmM, gen hspA, gen cagA, gen 23S rARN [23]. Bệnh nhân đƣợc xác
định nhiễm H. pylori (HPstatus +) nếu cho kết quả dƣơng tính với tất cả hoặc ít nhất là 3/4 gen nghiên cứu của vi khuẩn. Các mồi dùng trong phân tích đƣợc trình bày ở bảng dƣới đây:
Gen Mồi Trình tự mồi (5' - 3') Ta Kích thƣớc sp glmM [35] GlmM-F GGATAAGCTTTTAGGGGTGTTAGGGG 580C 296 bp GlmM-R GCTTACTTTCTAACACTAACGCGC hspA [40] Hsp-F GCTATCTGAAAATTTGATTTCTTTTGC 520C 384 bp Hsp-R TGCGCTATAGTTGTGTCGC cagA [66] CAGAF GATAACAGGCAAGCTTTTGAGG 500C 349 bp CAGAR CTGCAAAAGATTGTTTGGCAGA 23S rARN [11] 23S-F CTCCATAAGAGCCAAAGCCC 600C 425 bp 23S-R CCACAGCGATGTGGTCTCAG
Mẫu PCR tiến hành trong tổng thể tích 25 µl bao gồm các thành phần:
- ddH2O 18,375 µl - ADN khn 1 µl - Dung dịch đệm 10X 2,5 µl - Mồi xi 10 µM 0,5 µl - Mồi ngƣợc 10 µM 0,5 µl - dNTPs 2,5 mM 2 µl
- Taq ADN polymerase 10U/µl 0,125 µl
2.3.9. PCR nhân gen 23S rARN của H. pylori
1-10 ng ADN tách chiết từ các chủng vi khuẩn đƣợc sử dụng làm khuôn để khuếch đại gen 23S rARN của H. pylori. Cặp mồi đƣợc sử dụng để nhân toàn bộ gen
23S rARN có trình tự nhƣ Agudo và cộng sự (2010) đã miêu tả [11]:
Mồi Trình tự mồi (5' - 3') Kích thƣớc sản phẩm PCR (bp)
23S-F CTCCATAAGAGCCAAAGCCC 425
Chƣơng trình chạy PCR: - Bƣớc 1: T = 94oC, 5 phút - Bƣớc 2: T = 94oC, 30 giây - Bƣớc 3: T = 60oC, 30 giây - Bƣớc 4: T = 72oC, 30 giây Lặp lại 35 chu kỳ từ bƣớc 2 đến bƣớc 4 - Bƣớc 5: T = 72oC, 5 phút
2.3.10. PCR nhân gen 16S rARN của vi khuẩn
1-10 ng ADN tách chiết từ các chủng vi khuẩn đƣợc sử dụng làm khuôn để khuếch đại gen 16S rARN của vi khuẩn. Cặp mồi đƣợc sử dụng để nhân toàn bộ gen
16S rARN [63]: Mồi Trình tự mồi (5' - 3') Kích thƣớc sản phẩm PCR 8F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG ~ 1,5 kb 1492R GGTTACCTTGTTACGACTT Chƣơng trình PCR: - Bƣớc 1: T = 94oC, 5 phút - Bƣớc 2: T = 94oC, 60 giây - Bƣớc 3: T = 55oC, 45 giây - Bƣớc 4: T = 72oC, 45 giây Lặp lại 35 chu kỳ từ bƣớc 2 đến bƣớc 4 - Bƣớc 5: T = 72oC, 5 phút 2.3.11. Giải trình tự
Sản phẩm PCR khuếch đại gen của các chủng vi khuẩn đƣợc làm sạch bằng Kit QIAquick PCR Purification của hãng Qiagen (Đức), và đƣợc gửi đi giải trình tự tại hãng Macrogen (Mỹ). Kết quả giải trình tự của gen có thể mang lỗi nhƣ đọc thiếu nucleotide; không xác định đƣợc nucleotide; các nucleotide bị gối lên nhau... Vì vậy
cần tiến hành phân tích những sai sót đó, căn cứ vào trình tự trên hai mạch đơn theo nguyên tắc bổ sung giữa hai mạch.
2.3.12. Định tên vi khuẩn
Các trình tự gen 16S rARN thu đƣợc sau khi giải trình tự đƣợc quét bằng chƣơng trình Blast qua kho dữ liệu NCBI Databases để so sánh với trình tự các vi sinh vật đã biết lƣu trữ trong Database, qua đó định tên chủng vi khuẩn.
CHƢƠNG III
3.1. ĐẶC ĐIỂM CÁC BỆNH NHÂN 3.1.1. Đặc điểm tuổi, giới, độ pH dạ dày 3.1.1. Đặc điểm tuổi, giới, độ pH dạ dày
Các đặc điểm về tuổi và giới tính của các bệnh nhân tham gia nghiên cứu (danh sách bệnh nhân đƣợc liệt kê trong phần phụ lục I) đƣợc liệt kê ở bảng 1.
Bảng 1. Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo nhóm tuổi và giới tính
Giới Nhóm tuổi Tổng <19 <20-29 <30-39 <40-49 <50-59 >60 Nam 0 4 7 2 2 0 15 Nữ 0 3 4 3 2 0 12 Tổng 0 7 11 5 4 0 27 Tỉ lệ % 0 25,9 40,7 18,5 14,8 0 100 Tuổi trung bình 36,3
Qua bảng, có thể thấy viêm dạ dày cấp tính chảy máu gặp chủ yếu ở các bệnh nhân có độ tuổi trung bình là 36,3, nhiều nhất ở nhóm tuổi 30-39 với tỷ lệ 40,7%. Kết quả này tƣơng tự nhƣ trong nghiên cứu của Bs. Sinh, Bệnh viện Giao thông Vận Tải năm 2010 [9]. Trong số 27 bệnh nhân nghiên cứu, nam có 15 trƣờng hợp chiếm tỷ lệ 55,6 %, nữ có 12 trƣờng hợp chiếm tỷ lệ 44,4 %. Sự khác biệt giữa 2 giới khơng có ý nghĩa thống kê (P>0,05). Kết quả này cũng khá giống với một số nghiên cứu khác [9], [1].
Tuy nhiên, khi so sánh với các nghiên cứu của một số tác giả khác trong nƣớc và ngoài nƣớc thì độ tuổi trung bình của các bệnh nhân bị viêm dạ dày cấp tính chảy máu trong nghiên cứu của chúng tôi trẻ hơn nhiều [4], [2], [27], [16]: cả những ngƣời <30 tuổi cũng bị chảy máu. Sự trẻ hóa tuổi trung bình của các bệnh nhân cho thấy có sự thay đổi đặc điểm dịch tễ của bệnh.
Khả năng tiết dịch vị dạ dày của đa số các bệnh nhân (96,3 %) hồn tồn bình thƣờng (Hình 8): pH dịch vị trung bình ~2.5, chỉ có bệnh nhân số 25 có pH dịch vị
kiềm ~8.
Hình 8. Xác định độ pH dịch dạ dày của 27 bệnh nhân bị chảy máu dạ dày
3.1.2. Hình ảnh nội soi dạ dày của các bệnh nhân
Các hình ảnh chụp nội soi chảy máu dạ dày của các bệnh nhân đƣợc trình bày ở hình 9. Xem xét hình ảnh, có thể nhận thấy niêm mạc dạ dày ngƣời bệnh bị phù nề, có các vùng trợt và xuất huyết. Các vết trợt và vị trí chảy máu phân bố lan tỏa khắp niêm mạc hoặc phân bố khƣ trú. Tại địa điểm bị chảy máu có thể có những đám bầm tím hoặc chảy màu vào trong lịng dạ dày.
Các bệnh nhân 1, 3, 5, 6, 9, 10, 12, 14, 15, 18, 21 có hình ảnh nội soi chảy máu
dạ dày mức độ nhẹ, nốt chảy máu nhỏ màu đỏ hoặc nâu sẫm rải rác. Các bệnh nhân 7, 8, 11, 16, 17, 19, 24, 25, 26 chảy máu dạ dày mức độ vừa, có một lƣợng vừa phải những nốt nhỏ, vừa, mảng trợt xuất huyết nhỏ màu đỏ, nâu hoặc đen trên nền niêm mạc dạ dày phù nề, xung huyết. Các bệnh nhân 2, 4, 13, 20, 22, 23, 27 chảy máu dạ dày mức độ nặng, có nhiều mảng viêm trợt vừa và lớn trong dạ dày, hình ảnh là những mảng viêm trợt đen.
3.2. XÁC ĐỊNH HP STATUS CỦA CÁC BỆNH NHÂN
Nhiễm H. pylori, hay còn đƣợc gọi là HPstatus của 27 bệnh nhân đƣợc xác định dựa trên kết quả phân tích 4 gen chỉ thị của vi khuẩn (bao gồm gen glmM, gen hspA,
Hình 9. Ảnh chụp dạ dày xuất huyết
của 27 bệnh nhân 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27
gen cagA, gen 23S rARN. PCR nhân các gen này trực tiếp từ mẫu ADN genome tách từ sinh thiết dạ dày của bệnh nhân.
Chúng tôi xem xét đồng thời nhiều gen bởi lẽ trên thực tế, rất nhiều chủng H.
pylori có thể có hoặc khiếm khuyết một số gen, nghĩa là có khả năng mẫu bệnh phẩm
chứa vi khuẩn H. pylori nhƣng vì khơng có gen nên khơng đƣợc thể hiện trên kết quả PCR. Bên cạnh đó, lại có thể có những lồi vi khuẩn khác chƣa biết cũng có chứa những gen tƣơng tự nhƣ gen của H. pylori, đồng nghĩa với việc, có sự xuất hiện của
gen nhƣng chƣa chắc sản phẩm PCR ấy đã đƣợc khuếch đại từ gen của H. pylori. Việc kết hợp nghiên cứu trên nhiều gen và thống kê sự xuất hiện đồng thời của các gen ấy trong mẫu ADN bệnh phẩm cho phép chúng tôi khẳng định chắc chắn hơn về sự xuất hiện của vi khuẩn H. pylori trong mẫu sinh thiết bệnh nhân, cũng nhƣ tỷ lệ nhiễm H. pylori ở các bệnh nhân này.
Kết quả nhân từng gen đƣợc trình bày trong bảng 2. Bệnh nhân đƣợc cho là bị nhiễm H. pylori đƣợc xác định là có chứa tất cả hoặc ít nhất là 3/4 gen nghiên cứu. Sau khi thống kê sự xuất hiện của các gen, chúng tôi xác định đƣợc tỷ lệ bệnh nhân nhiễm HP là 23/27 bệnh nhân, chiếm 85,19%.
Nhiễm H. pylori là một trong các nguyên nhân gây viêm dạ dày cấp tính chảy máu ở ngƣời. Ngồi gây bệnh, vi khuẩn H. pylori, do ức chế tiết axit dạ dày, còn thúc đẩy quá trình định cƣ của các loại vi khuẩn khác trong Microbiota dạ dày. Trong nghiên cứu của chúng tôi, các bệnh nhân nhiễm H. pylori hay mang HPstatus+ chiếm 85,19 %. Tỉ lệ này cao hơn so với kết quả trong nghiên cứu của các tác giả khác trong nƣớc. Theo Quách Trọng Đức và cộng sự (2009), tỷ lệ nhiễm H. pylori chỉ là 49,6 % [3]; còn trong nghiên cứu của GS Tạ Long và cộng sự (2010), tỷ lệ này dao động từ 61,2 đến 78,9 % [8]. Con số này cũng cao hơn so với tỷ lệ nhiễm ở các nƣớc phát triển có điều kiện kinh tế - xã hội nhƣ Ý 46,9 % [26]; Nhật Bản 47,8 % [59].
Bảng 2. Kết quả phân tích 4 gen chỉ thị của vi khuẩn H. pylori của 27 bệnh nhân
STT Mã số BN
PCR
glmM hspA cagA 23S rRNA
1 1B - + + + 2 2B - - - - 3 3B + + + + 4 4B + + + + 5 5B + + + + 6 6B - + + + 7 7B + + - + 8 8B + + + + 9 9B + + + + 10 10B - - - - 11 11B + + + + 12 12B + + + + 13 13B - - - - 14 14B + + + + 15 15B + + + + 16 16B - - - - 17 17B + + + + 18 18B + + + + 19 19B + + + + 20 20B + + + + 21 21B + + + + 22 22B + + + + 23 23B + + + + 24 24B + + + + 25 25B + + + + 26 26B + + + + 27 27B + + + +
Số ngƣời nhiễm H. pylori cao ở các bệnh nhân bị viêm dạ dày cấp tính chảy máu xác nhận vai trị gây bệnh lý của vi khuẩn, mặt khác báo động tình trạng đỏ của vệ sinh cộng đồng và vệ sinh an tồn thực phẩm cũng nhƣ tình trạng ơ nhiễm mơi trƣờng hiện nay.
3.3. PHÂN LẬP CÁC VI KHUẨN Ở ĐIỀU KIỆN KỊ KHÍ
Vi khuẩn đƣợc phân lập từ sinh thiết dạ dày của 27 bệnh nhân trong điều kiện kị khí. Để đảm bảo các khuẩn lạc nhận đƣợc là vi khuẩn phát triển từ mẫu bệnh, một đĩa mơi trƣờng máu đƣợc trải với 30 µl dịch NaCl đƣợc sử dụng làm mẫu đối chứng âm. Sau 3-5 ngày ở điều kiện kỵ khí, 23/27 (85,1%) các mẫu bệnh phẩm cho kết quả ni cấy dƣơng tính.
Bảng 3. Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm vi khuẩn
Số bệnh nhân nhiễm vi khuẩn (n = 27) Số lƣợng Tỷ lệ
Âm tính 4 14,81%
Dƣơng tính 23 85,19%
Kết quả cho thấy, một bệnh nhân có thể (i) bị nhiễm một hay nhiều loại vi khuẩn; (ii) các khuẩn lạc đa dạng về hình thái, màu sắc, kích thƣớc, số lƣợng; (iii) các đĩa nuôi cấy giữa các bệnh nhân khác nhau mang các khuẩn lạc khác nhau (Hình 10).
Hình 10. Hình ảnh các khuẩn lạc vi khuẩn trên đĩa thạch máu của một số bệnh nhân
Nguyễn Văn T. 57t (A); BN Vũ Ngọc C. 34t (B); BN Nguyễn Thị H. 57t (C)
Đặc biệt, trên nhiều đĩa nuôi cấy đầu tiên còn thấy một loại khuẩn lạc màu trắng trong, nhỏ li ti nhƣ đầu mũi kim, có trƣờng hợp nhƣ những phẩy bụi bé rất khó nhận thấy (Hình 11). Bằng kinh nghiệm chúng tôi nhận thấy chúng rất giống với khuẩn lạc của Helicobacter pylori, một loại vi khuẩn cƣ trú thƣờng xuyên trong Microbiota dạ dày ngƣời [45].
Để khẳng định chúng có phải là H. pylori khơng, các phân tích bao gồm (i) test
thử Urease; (ii) nhuộm Gram trên tiêu bản; (iii) kiểm tra sự có mặt của gen 23S rARN đƣợc tiến hành. Những vi khuẩn nào có hình dấu phẩy đặc trƣng dƣới kính hiển vi, bắt màu hồng đỏ với thuốc nhuộm Gram (Hình 12); dƣơng tính với test Urease (Hình 13), và mang gen 23S rARN tƣơng đồng >98 % với gen 23 S rARN của H. pylori (Hình 14) đƣợc xác định là H. pylori. (Trình tự gen 23S rARN của các chủng H. pylori đƣợc trình bày ở Phụ lục IV). Hình 15 là một số chủng trong số 16 chủng H. pylori đƣợc phân lập ở điều kiện kị khí.
Hình 11. Hình ảnh
các khuẩn lạc
đƣợc nhận định giống với H. pylori
Hình 12. H. pylori sau khi nhuộm Gram dƣới kính hiển vi quang học
Hình 14. Sản phẩm PCR khuếch đại gen 23S rARN xác định H. pylori
(1-16): Sản phẩm PCR gen 23S rARN, (N): đối chứng âm, (D): đối chứng dƣơng
Hình 13. Kết quả thử hoạt tính Urease
bằng Helicotest
Dƣơng tính: mẫu 2, 3, 4 và 6 (màu đỏ cánh sen). Âm tính: 1 và 5 (màu vàng)
Hình 15. Các chủng H. pylori phân lập ở điều kiện kị khí
Đối với các khuẩn lạc vi khuẩn khơng phải H. pylori mọc đa dạng trên đĩa nhƣ đã chỉ ra ở trên, chúng tôi cũng tiến hành các bƣớc phân lập và làm sạch từng loại khuẩn lạc ở điều kiện kị khí. q trình đƣợc nhắc laị từ 3-5 lần cho đến khi nhận đƣợc chủng vi khuẩn thuần nhất, không bị nhiễm. Kết quả phân lập đƣợc 26 chủng vi khuẩn ngoài H. pylori. Các khuẩn lạc vi khuẩn mọc tốt, đồng nhất, và thể hiện rõ sự khác biệt về hình dạng, màu sắc, kích thƣớc khuẩn lạc giữa các chủng. Hình 16 là đĩa phân lập cuối cùng của một số chủng vi khuẩn.
3.4. NGHIÊN CỨU CÁC VI KHUẨN
3.4.1. Xác định Gram của các chủng phân lập
Các vi khuẩn phân lập ở điều kiện kị khí đƣợc xác định sau nhuộm Gram đa phần là Gram dƣơng (Hình17).
Hình 17. Ảnh chụp một số chủng vi khuẩn dƣới kính hiển vi Olympia
Các vi khuẩn phân lập ở điều kiện kị khí thường là loại Gram dương (số 1,2,3,5,6) chỉ có số ít là loại Gram âm (số 4)
3.4.2. Định tên vi khuẩn
Để xác định các vi khuẩn nhận đƣợc là lồi nào, chúng tơi tiến hành các bƣớc tách chiết ADN từ các chủng vi khuẩn phân lập, nhân bản toàn bộ gen 16S rARN. Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra trên gel Agarose 1.5 % (Hình 18), sau đó đƣợc tinh sạch và đọc trình tự gen. Trình tự 16S rARN đƣợc trình bày ở phụ lục III.
1 2 3
1 2 3 4 N P
Hình 18. Sản phẩm PCR khuếch đại từ gen 16S rARN
(1-4): Sản phẩm PCR gen 16S rARN của chủng phân lập số 1 đến chủng 4 N: đối chứng âm, P: đối chứng dƣơng
Các trình tự 16S rARN của các chủng vi khuẩn phân lập sẽ đƣợc xử lý bằng
chƣơng trình Blast trên kho dữ liệu NCBI Database để so sánh với các chủng trên ngân hàng thế giới, qua đó định tên lồi vi khuẩn. Vi khuẩn định tên có gen 16S rARN tƣơng đồng ít nhất 98% với gen 16S rARN của loài vi khuẩn đã biết. Ví dụ, một chủng vi
khuẩn đƣợc định tên là Rothia dentocariosa có gen 16S rARN giống 100% với vi