CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.5. LAMP, nguyên lý và ứng dụng
1.5.4. Ứng dụng của LAMP trong chẩn đoán bệnh cây trồng
Được bắt đầu nghiên cứu năm 1998, công bố lần đầu tiên năm 2000, nhưng trong khoảng chục năm tiếp theo, đã có đến hơn 250 cơng trình nghiên cứu khoa học áp dụng kỹ thuật này được công bố trên các tạp chí uy tín [52]. Từ kỹ thuật LAMP truyền thống, có nhiều phiên bản mới ra đời làm cho ứng dụng của kỹ thuật này càng trở nên phổ biến [22]. Trên thế giới, được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học khác nhau, trong đó vẫn tập trung chủ yếu vào khía cạnh chẩn đốn. LAMP chủ yếu được ứng dụng và phát triển để xác định các nguồn gây bệnh cho thực vật, động vật và con người, bao gồm vi nấm, vi khuẩn và virus nhờ các ưu điểm đặc biệt của kỹ thuật này [75]. Trên đối tượng thực vật, kỹ thuật LAMP đã phát huy thế mạnh của mình trong việc nhận dạng hàng loạt tác nhân gây bệnh khác nhau như vi nấm, vi khuẩn, virus.
Vi khuẩn là đối tượng vi sinh vật được biết từ rất lâu, cũng được đánh giá là tác nhân quan trọng gây rất nhiều bệnh trên các loại cây trồng. Trong lĩnh vực chẩn đoán, cùng với PCR và các kỹ thuật phát triển từ PCR thường được áp dụng để phát hiện vi khuẩn, LAMP cũng được áp dụng phổ biến để nhận dạng đối tượng này. Kỹ thuật LAMP có thể xác định được vi khuẩn Phytophthora sojae gây bệnh nâu gốc, héo thân, vàng lá dẫn đến chết cây, với nồng độ ADN cần thiết chỉ 10 pg/µl [21]. Nghiên cứu của Li và cs (2007) áp dụng kỹ thuật LAMP để nhận biết tác nhân “Candidatus Liberibacter Species” gây bệnh trên cây cam, chanh cho thấy với hơn 200 mẫu cây bệnh được kiểm tra, chỉ có 3 mẫu khơng phát hiện thấy phytoplasma có xuất hiện triệu chứng cho thấy hiệu quả phát hiện tác nhân vi khuẩn của phản ứng LAMP, trong nghiên cứu này, lên đến gần 99%. Bên cạnh đó, rất nhiều mẫu bệnh khơng thể phát hiện được bằng PCR đã được LAMP phát hiện dễ dàng, cho thấy độ nhạy vượt trội của nó [65]. Cũng nghiên cứu trên đối tượng cam chanh, Okuda và cs (2005) đã thiết kế mồi LAMP đặc hiệu nhận biết đoạn gen mã hóa cho operon rplKAJL-rpoB cho thấy, phản ứng LAMP có độ nhạy rất cao khi chỉ yêu cầu lượng khoảng 1 ng ADN mẫu nhiễm bệnh, đủ để nhận biết sự có mặt của phytoplasma hay khơng [81]. Nghiên cứu của Rigano và cs (2010) còn khẳng định với độ đặc hiệu và độ nhạy cao, LAMP có giới hạn phát hiện đối với ADN sạch là 10 fetogram (fg), 5 CFU đối với tế bào được nuôi cấy và 18 CFU đối với mẫu được tách từ mô lá bị nhiễm bệnh đốm trắng ở lá, thân cũng như quả cam chanh [91].
Kỹ thuật LAMP được phát triển và thực sự trở thành một công cụ hữu hiệu để nhận dạng các tác nhân virus thực vật như virus khảm thuốc lá, chuối, súp lơ, đào, vius chấm vàng ở cà khua, khoai tây, virus gây vàng lá ở lúa mì, virus vàng lùn ở lúa, và các loại virus khác được xác định trên các loài hoa [34, 58, 67, 85, 101, 108]. Banana streak virus (BSV) là virus gây bệnh trên cây chuối cũng được xác định thông qua kỹ thuật LAMP với độ nhạy đạt tới 1 pg/μl ADN khn. Kiểm tra trên tồn bộ các mẫu thu thập được cho thấy, LAMP có độ nhạy cao hơn PCR với cùng mẫu tương ứng [85]. Đáng chú ý là nghiên cứu của Le và cs (2010) áp dụng RT-LAMP để xác định 9 loài virus gây bệnh trên lúa, với độ nhạy gấp 10 lần RT-PCR [58]. Trong khi đó, Wei và cs (2012) nghiên cứu bệnh đốm vằn trên hạt đậu tương gây ra bởi virus Bean pod mottle virus, nhận thấy, RT-LAMP khơng chỉ có độ chính xác cao, đặc hiệu cao mà cịn có độ nhạy cao 100-1000 lần đối với kỹ thuật RT-PCR với cùng mẫu tương ứng [105]. Zhang và cs (2011) cũng xác định được virus gây bệnh khảm trên cây lúa mỳ với kỹ thuật LAMP với độ nhạy cao hơn kỹ thuật PCR thông thường khoảng 100 lần [108]. Mặc dù vậy, vẫn còn khá nhiều virus cây trồng mà kỹ thuật LAMP chưa nghiên cứu đến như virus gay còi khoai tây, lạc hay virus gây bệnh bạc lá, virus gây bệnh khảm trên xà lách, lúa mì, mía, hoặc vius gây bệnh khảm ở một số loài hoa [93].
Tuy nhiên, cũng như các kỹ thuật phân tử khác, LAMP cũng chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu áp dụng với tác nhân phytoplasma, mặc dù nó vẫn là cơng cụ nhận dạng hữu hiệu. Nổi bật hơn cả là nghiên cứu của Tomlinson và cs (2010), Bekele và công sự (2011) và Ravindran và cs (2012) [11, 87, 99]. Trong nghiên cứu của Tomlinson, kỹ thuật LAMP được ứng dụng để nhận dạng phytoplsma gây bệnh vàng úa trên hoa cúc. Đoạn ADN giữa 2 vùng gen 16S và 23S được sử dụng để thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng. tiến hành phản ứng trong 45 phút ở 65°C, kết quả cho thấy LAMP có hiệu quả tương đương với Nested PCR, tuy nhiên, thời gian thực hiện được rút ngắn đáng kể. Tương tự, nghiên cứu của Bekele và cs (2011) đánh giá LAMP là kỹ thuật nhanh chóng, kinh tế, hiệu quả và đáng tin cậy trong chẩn đoán phytoplasma gây bệnh cây trồng. Trong khi đó, Ravindran và cs (2012) đã thiết kế một bộ sáu mồi đặc hiệu cho gen 16S rADN của Ca.
Liberibacter solanacearum cũng được sử dụng để phát hiện phytoplasma kí sinh trong
cây khoai tây và trong bọ rầy là sinh vật dẫn truyền. Nghiên cứu này đã tiến hành chuẩn hóa tồn bộ điều kiện của phản ứng LAMP, bao gồm nồng độ ion Mg2+, nồng độ enzyme
xúc tác cùng với thời gian và nhiệt độ phản ứng. Theo đó, 60°C trong 60 phút được coi là điều kiện phù hợp cứu cho phản ứng LAMP trong nghiên này. Bên cạnh đó, LAMP cũng được đánh giá có độ nhạy tương đương PCR nhưng thời gian thử nghiệm được rút ngắn, trong khi độ chính xác cao, tính tin cậy và mức độ đặc hiệu là những tính năng mạnh mẽ của kỹ thuật này [87].
Ở Việt Nam, kỹ thuật LAMP còn khá mới mẻ, do đó, chưa được áp dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu khoa học cũng như ứng dụng trong thực tế. Hầu hết các công bố gần đây chỉ sử dụng mẫu vật thu thập từ Việt Nam nhưng thực hiện liên kết ở các phịng thí nghiệm nước ngồi, do đó, những nghiên cứu hoàn toàn ở Việt Nam rất ít. Nghiên cứu đầu tiên được thực hiện và công bố ở Việt Nam là của Hoàng Phú Hiệp và Lê Quang Huấn (2012) trên đối tượng vi khuẩn E. coli, sử dụng kỹ thuật in situ LAMP, một biến thể của kỹ thuật LAMP truyền thống sử dụng một cặp mồi phía trong, tuy nhiên, thí nghiệm này gần như thực hiện lại nghiên cứu của Maruyama và cs công bố năm 2003 trên tạp chí Vi sinh vật học Ứng dụng và Môi trường thuộc Hiệp hội Vi sinh vật học Hoa Kỳ [1, 69]. Gần đây, nhóm nhà khoa học của Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam đã có cơng bố mới về ứng dụng kỹ thuật LAMP để phát hiện bệnh Opisthorchiasis do loài sán
Opisthorchis viverrini gây ra trên các lồi cá ni ở đồng bằng Nam Bộ, cũng tạo ra một
hướng mới trong chẩn đoán bệnh động vật [59]. Tuy nhiên, trên đối tượng thực vật nói chung và cây trồng nói riêng, kỹ thuật LAMP vẫn chưa được ứng dụng trong nhận biết và chẩn đoán bệnh trên các đối tượng này. Do đó, có thể nói việc ứng dụng kỹ thuật LAMP để chẩn đốn bệnh cây trồng mà chúng tơi tiến hành là nghiên cứu đầu tiên và phát triển thành công kit chẩn đoán nhanh là một lĩnh vực áp dụng hoàn toàn mới ở Việt Nam.