CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.5. Phƣơng pháp xác định đa dạng mất đoạn APOBEC3B
1.5.3. Phƣơng pháp PCR
Phƣơng pháp PCR xác định đa dạng mất đoạn APOBEC3B đƣợc Kidd và
cộng sự áp dụng lần đầu tiên vào năm 2007 [31]. Phƣơng pháp này sử dụng hai cặp mồi Ins-F/R và Del-F/R. Cặp mồi Ins-F/R đƣợc thiết kế để khuếch đại đoạn DNA mang kích thƣớc 490 bp đặc hiệu với alen nguyên vẹn. Cặp mồi Del-F/R đƣợc sử dụng để khuếch đại đoạn DNA mang kích thƣớc 700 bp đặc hiệu với alen mất đoạn. Vị trí các mồi trình bày trên Hình 1.12.
Hình 1.12. Vị trí mồi xác định đa dạng mất đoạn APOBEC3B trong kỹ thuật PCR.
Exon trên hai gen APOBEC3A và APOBEC3B đƣợc thể hiện bằng màu đỏ và xanh. Khung gạch chéo thể hiện trình tự 350 bp tƣơng đồng của hai gen [31].
Cặp mồi Ins-F/R không khuếch đại đƣợc sản phẩm từ alen mất đoạn trong phản ứng PCR vì mồi Ins-F khơng có vị trí gắn trên alen này. Cặp mồi Del-F/R cũng không thể khuếch đại đoạn DNA kích thƣớc 30 kb trên alen nguyên vẹn vì khống chế thời gian kéo dài trong chu trình PCR. Kết quả PCR đƣợc quan sát trên
phƣơng pháp PCR xác định đa dạng mất đoạn APOBEC3B tiếp tục đƣợc sử dụng
trong nghiên cứu của Rezaei (2015) và Revathidevi (2016) [47, 48]. Qua đó xác định tần suất alen mất đoạn tại nam Ấn Độ và phía nam Iran cũng nhƣ mối liên hệ của đa dạng mất đoạn với nguy cơ ung thƣ vú tại hai khu vực này.
Trên đây là ba phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng để xác định kiểu gen đa dạng mất đoạn tuy nhiên mỗi phƣơng pháp đều có những ƣu nhƣợc điểm riêng. Ƣu điểm của phƣơng pháp MLPA là đơn giản, có độ chính xác cao. Tuy nhiên, phƣơng pháp này cũng có một vài hạn chế nhƣ bao gồm nhiều công đoạn và đòi hỏi thời gian thực hiện (riêng thời gian lai có thể kéo dài đến 6 tiếng), do đó thƣờng tốn thời gian và công sức [44]. Realtime-PCR là một kỹ thuật định lƣợng có độ nhạy cao vì sử dụng tín hiệu huỳnh quang và tiết kiệm thời gian, công sức khi cho kết quả hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ mà không cần phải điện di sản phẩm. Tuy nhiên, đây là phƣơng pháp có chi phí cao do yêu cầu hóa chất phát huỳnh quang [8]. Phƣơng pháp PCR có chi phí rẻ, đơn giản và thích hợp với điều kiện phịng thí nghiệm của chúng tơi. Vì vậy, chúng tơi đã sử dụng phƣơng pháp này để thực hiện đề tài:
“Phân tích đa dạng di truyền mất đoạn APOBEC3B và nguy cơ bị ung thư vú ở
người Việt Nam” nhằm mục tiêu: (1) Đánh giá liên hệ giữa đa đạng di truyền mất
đoạn APOBEC3B và nguy cơ ung thƣ vú; (2) Xác định tần suất alen mất đoạn APOBEC3B tại Việt Nam; (3) Khảo sát sự thay đổi đa dạng mất đoạn APOBEC3B