Giống nhƣ hầu hết các loại vi rút ARN sợi (-), vi rút cúm nhân lên trong nhân của tế bào bị nhiễm. Sau khi dung hợp với màng tế bào, phức hợp của
ribonucleoprotein của vi rút (vRNP) đƣợc phóng thích vào tế bào chất. Phức hợp vRNP, bao gồm ARN của vi rút (vARN), nucleoprotein (NP) và 3 loại protein polymeraza (PA, PB1, PB2), đƣợc chuyển vào nhân và quá trình phiên mã tái bản diễn ra tại đây, vARN sợi (-) không thể trực tiếp làm khuôn tổng hợp protein mà vARN đƣợc bao bọc trong NP phải đƣợc phiên mã thành mARN nhờ phức hợp polymeraza của vi rút. Trong quá trình tái bản vARN đƣợc sử dụng làm khn để tổng hợp sợi ARN bổ sung (cARN), sợi cARN này lại đƣợc làm khuôn để tổng hợp sợi vARN. Nhƣ vậy, đơn vị chức năng tối thiểu để vi rút cúm có thể tái bản là vRNP.
Những nỗ lực tạo ra vi rút cúm trong phịng thí nghiệm từ những năm 1980 khi Plotch và Beaton, Krug tinh khiết đƣợc vRNP từ những vi rút bị phá hủy bằng chất tẩy rửa và từ tế bào bị gây nhiễm. Đến cuối thập niên 80, Parvin và sau đó là Honda đã thành công trong việc tái tạo phức hợp RNP có hoạt tính trong phịng thí nghiệm từ những thành phần polymeraza NP riêng lẻ. Từ đấy rất nhiều hệ thống di truyền ngƣợc để tạo ra vi rút cúm đã đƣợc phát triển. Hệ thống di truyền ngƣợc đầu tiên đƣợc Palese và cộng sự thiết lập vào năm 1989 [33].
Một đoạn ARN tách chiết từ vi rút hoặc phiên mã từ cDNA trong phịng thí nghiệm đƣợc ủ với polymeraza của vi rút (PA, PB1, PB2) và nucleoprotein (NP) tinh sạch để tái tạo ra phức hợp vRNP. Phức hợp rRNP này đƣợc biến nạp vào tế bào eukaryote đã bị gây nhiễm bằng một chủng vi rút cúm trợ giúp từ trƣớc, vi rút cúm trợ giúp có nhiệm vụ cung cấp các vRNP cịn lại. Kết quả tạo ra một chủng vi rút cúm tái tổ mới mang 7 đoạn ARN của vi rút cúm trợ giúp vào một đoạn ARN đƣợc biến nạp vào. Năm 1994, Hobom và các đồng nghiệp [36] đã sử dụng enzyme ARN polymeraza I để tổng hợp ARN của vi rút cúm bên trong tế bào, thiết lập một hệ thống khác để tạo ra vi rút cúm mà vẫn sử dụng tới vi rút trợ giúp. Tuy nhiên cơng trình này đã thúc đẩy việc ứng dụng kỹ thuật di truyền ngƣợc trong các nghiên cứu về vi rút cúm.
Trong các kỹ thuật di truyền ngƣợc sau này, vARN đƣợc tạo dòng cDNA trong các plasmid có khả năng tổng hợp vARN và các protein của vi rút cúm. Vì
vậy các gen của vurus cúm có thể đƣợc chủ động làm biến đổi theo ý muốn. Các plasmit mang các cDNA đƣợc biến nạp vào tế bào. Bên trong tế bào, vARN và các protein của vi rút đƣợc tổng hợp, sự lắp ráp các vARN và các protein dẫn đến sự hình thành vi rút mới bên trong tế bào. Các vi rút này có khả năng nhân lên và phát triển bình thƣờng nhƣ một vi rút đƣợc phân lập [35]. Năm 1999, Neumann và cộng sự đã tạo ra thành công vi rút cúm từ 17 plasmit ( 8 plasmit mã hóa tổng hợp 8 ARN của vi rút, 9 plasmit biểu hiện tổng hợp 9 loại protein). Sau đó hệ thống này đƣợc cải tiến, rút số plasmid phải sử dụng xuống 12.
Năm 2000, Hofmann và cộng sự đã cải biến hệ thống ARN polymeraza I thành hệ thống ARN polymeraza I/II. Đoạn cDAN đƣợc cài đặt giữa trình tự promoter ARN polymeraza II (cytomegalovi rút early promoter) và trình tự poly (A). Do đó, q trình phiên mã bằng ARN polymeraza I tạo ra ARN sợi âm của vi rút, cịn q trình phiên mã bởi ARN polymeraza II tạo ra sợi mARN. Nhƣ vậy cả vARN và mARN đƣợc tổng hợp cùng từ một khuôn, kết quả đã làm giảm số lƣợng plasmid cần dùng từ 12 xuống 8. Vì vậy, hệ thống này có thể sử dụng cho nhiều dòng tế bào hơn. Đến năm 2005, Neumann và cộng sự đã thiết lập đƣợc một hệ thống di truyền ngƣợc mới chỉ sử dụng từ 3 đến 4 plasmit. Đây là hệ thống mà rất nhiều cấu trúc phiên mã bởi ARN polymeraza I đƣợc kết hợp lại với nhau trong cùng một plasmid, cũng nhƣ các cấu trúc phiên mã bởi ARN polymeraza II đƣợc kết hợp vào một plasmid khác.
Sự thành công của hệ thống các plasmid mang nhiều trình tự AND mã hóa cho nhiều ARN, đã gợi ý rằng có tạo ra một hệ thống di truyền ngƣợc mới chỉ có một plasmid bằng cách kết hợp hệ thống trên và hệ thống ARN polymeraza I/II. Khi đó, plasmid duy nhất đƣợc thiết kế gồm 4 đơn vị phiên mã ARN polymeraza I/II cho các cDNA mã hóa PA, PB1, PB2, NP; 4 đơn vị phiên mã ARN polymeraza I cho 4 cDNA mã hóa cho HA, NA, M, NS.
Trong những năm gần đây kỹ thuật di truyền ngƣợc đã đƣợc áp dụng để tạo ra các chủng vi rút cúm có sự sắp xếp lại các đoạn gen và có khả năng nhân lên rất mạnh. Tùy từng trƣờng hợp, các chủng vi rút cúm có tỷ lệ sắp xếp lại gen theo tỷ lệ
6:2 đã đƣợc tạo ra. Trong đó các đoạn gen HA và NA của nhiều chủng vi rút cúm hoang dại khác nhau (bao gồm các chủng cúm ngƣời và gia cầm nhƣ A/H1N1, A/H3N2, A/H5N1 và H5N3) còn 6 đoạn còn lại là của chủng PR8 [32, 46, 65]. Quy trình kỹ thuật di truyền ngƣợc có sự tham gia của các tế bào động vật nhƣ các tế bào 293T, hỗn dịch tế bào 293T/MDCK và tế bào Vero [37]. Tuy nhiên nếu chủng vi rút đƣợc tạo ra nhằm mục đích làm chủng sản xuất thì theo TCYTTG khuyến cáo, không sử dụng tế bào 293T trong kỹ thuật di truyền ngƣợc [48].
Kỹ thuật di truyền ngƣợc đã đƣợc ứng dụng vào nhiều nghiên cứu, lĩnh vực khác nhau. Những chủng vi rút giảm độc lực đƣợc tạo bởi kỹ thuật di truyền ngƣợc có thể đƣợc sử dụng nhƣ là vắcxin sống để tạo kháng thể bảo vệ kháng lại vi rút hoang dại. Vi rút cúm tạo miễn dịch dịch thể, đáp ứng miễn dịch niêm mạc và miễn dịch tế bào mạnh. Hơn nữa, vi rút cúm là vi rút không gây ung thƣ. Kháng thể kháng lại các phân typ khác nhau của vi rút cúm khơng có hoặc rất ít miễn dịch chéo do vậy có thể dễ dàng vƣợt qua hàng rào bảo vệ của kháng thể có sẵn đối với các vector trong vật chủ. Những đặc tính quý nêu trên đã mang lại khả năng có thể sử dụng vi rút cúm nhƣ một vector vắcxin tiện lợi. Để tiêm chủng nhắc lại có hiệu quả, có thể dùng các phân typ vi rút cúm khác nhau sản xuất ra cùng một loại kháng ngun. Một vị trí đã đƣợc xác định có thể dung hịa kháng nguyên ngoại lai là vị trí kháng nguyên B của phân tử HA. Vi rút cúm phân typ H1 và H3 đã đƣợc sử dụng để biểu thị trình tự kháng nguyên ELDKWAS của vi rút HIV. Vi rút cúm cũng đƣợc sử dụng nhƣ là vector biểu thị kháng nguyên sốt rét và Pseudomonas aeruginosa [14, 40]. Chủng vi rút cúm tạo bởi kỹ thuật di truyền ngƣợc còn đƣợc sử
dụng để nghiên cứu chức năng vi rút.