CHƢƠNG II : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.6. Bố trí thí ngiệm
*Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hƣởng của nguồn mẫu và chất khử trùng để
tạo mẫu vô trùng.
Mẫu đƣợc khử trùng bằng NaClO 20% trong 5, 10, 15, 20 phút và cấy vào môi trƣờng: MS + 5 g/l agar + 30g/l đƣờng sucrose + 1mg/l PVP + 100mg/l nƣớc dừa.
*Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hƣởng của mơi trƣờng đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu lát cắt.
Các mẫu lát cắt cấy trên các công thức môi trƣờng MS + 100mg/l nƣớc dừa + 5 g/l agar + 30g/l đƣờng sucrose bổ sung các chất điều hòa sinh trƣởng nhƣ sau (ĐHST)
BAP 0-5 mg/l; 2,4D 0,5 - 5mg/l. Thí nghiệm ni cấy trong tối 15 ngày sau đó đƣa ra chiếu sáng bình thƣờng. Thời gian ni cấy 1,5 tháng.
*Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng đến khả năng nhân
của callus có nguồn gốc từ tế bào lát cắt mơ non.
Callus phát sinh từ thí nghiệm 2 cấy chuyển sang mơi trƣờng nhân MS + 100mg/l nƣớc dừa + 5 g/l agar + 30g/l đƣờng sucrose bổ sung 2mg/l BAP và 0,0 - 1mg/l NAA.
*Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hƣởng của khả năng tái sinh chồi từ callus
Callus từ thí nghiệm 3 cấy chuyển sang mơi trƣờng MS + 100mg/l nƣớc dừa + 5 g/l agar + 30g/l đƣờng sucrose bổ sung bổ sung Cazein 0-1,5g/l
*Thí nghiệm 5: Ảnh hƣởng của vitamin B1 đến khả năng nhân và sức sống
của chồi.
Các chồi mới tạo thành cấy chuyển sang môi trƣờng nhân chồi MS + 100mg/l nƣớc dừa + 5 g/l agar + 30g/l đƣờng sucrose + 0,1mg/lKi + 1,0 mg/l BAP bổ sung vitamin B1 0-4mg/l.
*Thí nghiệm 6: Ảnh hƣởng của NAA đến sinh trƣởng và phát triển cây in vitro. Chồi sau khi nhân đạt kích thƣớc 4-6cm cấy chuyển sang mơi trƣờng tạo cây
hồn chỉnh, mơi trƣờng MS + 100ml/l nƣớc dừa+5 g/l agar + 30g/l đƣờng sucrose + 3mg/l Vitamin B1 + bổ sung 0; 0,2; 0,3; 0,4mg/l NAA
*Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hƣởng của trạng thái môi trƣờng đến khả
năng tạo tạo rễ và phát triển cây hoàn chỉnh.
Cấy chuyển cây ra rễ đã đủ cứng cáp chuyển sang môi trƣờng ở trạng thái lỏng, bán lỏng, đặc. Xác định trạng thái môi trƣờng để cây sinh trƣởng tốt cả trong in vitro và cây đƣa ra ngoài vƣờn.
Để bình cây ra nhiệt độ Trong phịng 0-7 ngày (ánh sáng mạnh hơn in vitro + ngoài vƣờn) 0-7 ngày (ánh sáng tự nhiên cƣờng độ thấp). Đƣa cây ra cát ẩm, đƣa cây ra bầu giá thể.
*Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hƣởng của giá thể đến sinh trƣởng của cây
trồng sau in vitro ngoài vƣờn ƣơm
Giá thể sử dụng là (đất phù sa : xơ dừa) tỉ lệ (1:1), (đất phù sa: cát) tỉ lệ (1:1), 100% đất phù sa, 100% cát, 100% xơ dừa.
*Thí nghiệm 10: Ảnh hƣởng của loại phân bón và liều lƣợng đến sinh trƣởng
và phát triển của cây con
Grown more có (N:P:K) tỉ lệ (30:20:10, (30:10:10) và Phân komix Sông Gianh. Thời gian định kỳ phun 7-10 ngày/lần.
*Thí nghiệm 11: Nghiên cứu ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng đến sinh
trƣởng của cây sau in vitro ngồi vƣờn ƣơm Cơng thức che sáng dao động (3000 – 8000 lux)