2.3.6.1. Gắn đoạn gen của vi khuẩn O. tsutsugamushi, Rickettsia vào vector pTZ57R/T
Hai đoạn gen của vi khuẩn O. tsutsugamushi và Rickettsia được gắn vào
Bảng 2.4: Thành phần phản ứng ligation Thành phần Thể tích Vector pTZ57R/T 3 µl 5X ligation buffer 6 µl Sản phẩm PCR Tùy nồng độ và kích thước H2O nuclease-free 16-20 µl T4 DNA ligase 1 µl Tổng thể tích 30 µl
- Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ 22oC trong 1 tiếng.
2.3.6.2. Biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Tạo tế bào khả biến:
- Lấy 300 µl dung dịch DH5α từ tủ -86oC và ni hoạt hóa trong 8ml LB lỏng trong khoảng 2 giờ ở 37oC trên máy lắc tốc độ 200 vịng/phút. Chia dịch ni vào 2 ống effpendorf 1,5 ml và ly tâm ở 4000 vòng/phút để thu cặn tế bào
E.coli. Thêm 950µl CaCl2 0,1M lạnh để hòa tan cặn tế bào và ủ trên đá 30
phút. Sau khi ly tâm, cặn tế bào được rửa với 950µl CaCl2 0,1M lạnh. Tiếp tục ly tâm thu cặn tế bào E.coli và hịa tan vào 50 µl CaCl2 0,1M để tạo thành các ống tế bào khả biến.
Biến nạp vào tế bào khả biến:
- Bổ sung 1,5 µl vector tái tổ hợp đã được thực hiện ở trên vào 100 µl tế bào khả biến.
- Ủ trên đá 60 phút, sau đó sốc nhiệt 42oC trong 30s. Tiếp tục ủ trên đá 5 phút. - Bổ sung 1 ml LB lỏng vào mỗi ống. Nuôi ở 37oC trên máy lắc 200 vòng/phút
trong 60 phút.
- Ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút để thu cặn tế bào, sau đó hịa cặn trong 400 µl LB lỏng.
- Cấy trải 200 µl dung dịch tế bào lên đĩa thạch mơi trường LB có bổ sung ampicillin với nồng độ cuối là 50µg/mL, 40 µl X-Gal và IPTG mỗi loại và nuôi trong tủ 37oC qua đêm.
- Sau 12-16 giờ nuôi cấy sẽ quan sát thấy sự hình thành các khuẩn lạc.
Các khuẩn lạc E. coli DH5α tạo thành được kiểm tra bằng phương pháp PCR trực tiếp (conoly PCR). Khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp được chọn lọc và nuôi cấy trong mơi trường LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc ampicillin (nồng độ 50g/ml) từ 12 đến 16 tiếng ở 37oC 200 vòng/phút.
Tiến hành tách plasmid sử dụng bộ sinh phẩm GenJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo) theo quy trình nhà sản xuất cung cấp như sau:
- Bổ sung 250µl Resuspension Solution (đã có Rnase A) vào trong ống eppendoff có chứa cặn vi khuẩn. Trộn đều bằng pipet cho đến khi cặn tan hoàn toàn.
- Bổ sung 250µl Lysis Solution, lắc nhẹ ống eppendoff 4 đến 6 lần hoặc đến khi dung dịch đồng nhất.
- Bổ sung 350µl Neutralization Solution, lắc nhẹ ống eppendoff 4-6 lần. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút.
- Đặt cột lên trên ống thu. Chuyển toàn bộ dịch trong lên trên cột, sau đó ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút.
- Đổ bỏ dịch trong ống thu. Bổ sung 500µl Wash Solution vào trong cột, ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút. Bước này lặp lại 2 lần.
- Đổ bỏ dịch trong ống thu. Ly tâm khan 12000 vòng/phút trong 2 phút để loại bỏ hoàn toàn Wash Solution.
- Bổ sung 50µl Elution Buffer, để 2 đến 3 phút ở nhiệt độ phịng sau đó ly tâm 12000 vịng/phút trong 2 phút.
- Plasmid được bảo quản ở -20oC để dùng cho các thí nghiệm khác.
Sau đó, plasmid tái tổ hợp được kiểm tra bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu vector M13 (For&/Rev) để kiểm tra chính xác sự có mặt của đoạn gen đích. Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR được trình bày trong Bảng 2.5.
Bảng 2.5: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu vector M13
Thành phần Thể tích (µl) Chu trình 2X Mastermix DreamTaq Promega 12,5 94oC-5phút (94oC-30giây; 62oC-30giây; 72oC-2phút 30giây) 35 chu kỳ 72oC-10 phút 4oC ---------- Mồi M13 For (10pM) 1,0 Mồi M13 Rev (10pM) 1,0 Plasmid (10ng/µl) 1,0 H2O cho PCR 9,5 Tổng thể tích 25,0
Sản phẩm PCR sau khi điện di kiểm tra được tinh sạch bằng GenJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo) và xác định trình tự nucleotide trên hệ thống máy giải trình tự CEQ 8800 sequencer, Beckman Coulter, Mỹ.
2.3.7. Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng real-time PCR
Các phản ứng real-time PCR được tiến hành theo thành phần như sau:
Bảng 2.6: Thành phần phản ứng real-time PCR Thành phần Thể tích (µl) Chu trình H2O 3,5 95°C-15 phút (95°C-15giây; 60°C-1phút) 45 chu kỳ Master Mix QiaGen 10,0
Pri F (10 µM) 0,5 Pri R (10 µM) 0,5 Probe (10 µM) FAM 0,5 Plasmid/ ADN vi khuẩn 5,00
Tổng thể tích [µl] 20.00 Thời gian: 1giờ45phút
Thực hiện thí nghiệm trên 9 mẫu ADN tách từ 9 loại vi khuẩn: E.coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Samonella.sp, Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus,
Streptococcus suis và 1 mẫu ADN tách từ máu người khỏe mạnh. Đánh giá độ đặc
hiệu của real-time PCR phát hiện O. tsutsugamushi và Rickettsia, 09 mẫu ADN tách từ 9 vi khuẩn khác như trên, 02 mẫu ADN tách từ mẫu bệnh phẩm đã được khẳng định dương tính và plasmid pOri và pRick được sử dụng trong các phản ứng real- time PCR tương ứng với thành phần được mô tả ở trên.
2.3.8. Đánh giá độ nhạy của kĩ thuật real-time PCR
Đánh giá độ lặp lại và ngưỡng phát hiện, các plasmid chứng dương pOri và pRick được pha loãng đến các nồng độ 104, 103, 102, 101, 4, 2, 1 (bản sao/µl) và thực hiện phản ứng với 50 phản ứng lặp lại ở cả hai kĩ thuật real-time PCR phát hiện O. tsutsugamushi và Rickettsia, thành phần phản ứng như trình bày ở bảng 2.6.
2.4. Áp dụng hai kĩ thuật real-time PCR để chẩn đoán các mẫu bệnh phẩm nghi ngờ nhiễm O. tsutsugamushi và Rickettsia nghi ngờ nhiễm O. tsutsugamushi và Rickettsia
Tiến hành hai phản ứng real-time PCR với 87 mẫu bệnh phẩm nghi ngờ nhiễm Rickettsiaceae thu thập được tại Bệnh viện Trung ương quân đội 108 từ
tháng 6/2016 - 9/2017 với thành phần phản ứng như trình bày ở bảng dưới đây:
Bảng 2.7: Thành phần phản ứng real-time PCR phát hiện vi khuẩn Thành phần Thể tích (µl) Chu trình Thành phần Thể tích (µl) Chu trình H2O 2,0 95°C 15phút (95°C-15giây ; 60°C-1phút) 45 chu kỳ Master Mix QiaGen 10,0
Pri F (10 µM) 0,5 Pri R (10 µM) 0,5 Probe (10 µM) FAM 0,5 Primer MS2 R 0,5 Primer MS2 F 0,5 Probe MS2 0,5 ADN vi khuẩn 5,00
Chƣơng 3 - KẾT QUẢ
3.1. Xây dựng kĩ thuật real-time PCR phát hiện vi khuẩn O. tsutsugamushi và các loài Rickettsia. các loài Rickettsia.
3.1.1. Thiết kế primer, probe đặc hiệu cho phản ứng PCR, real-time PCR
Vào cuối những năm 1980, PCR bắt đầu được sử dụng để phát hiện ADN
Rickettsia và sau đó đã trở thành phương pháp nhanh chóng, đáng tin cậy để chẩn
đốn các bệnh do Rickettsia gây ra. Các gen đích đặc hiệu phát hiện Rickettsia được ứng dụng trong phát triển kĩ thuật PCR là 17kDa, gen gltA (gen tổng hợp citrate) và gen ompA, ompB [19, 48, 54, 67]. Trong đó gltA là gen có tính bảo thủ cao giữa các lồi Rikettsia gây bệnh ở người [57]. Chính bởi sự bảo thủ và ít biến đổi đó, mà gen
gltA được lựa chọn làm gen đích cho phản ứng real-time PCR phát hiện Rickettsia [63]. Các vùng gen 47kDa, 56kDa, groEL được các nhà khoa học lựa
chọn là các vùng gen đích để nghiên cứu phát hiện O. tsutsugamushi bằng phương pháp PCR thay thế cho các phương pháp huyết thanh học còn nhiều hạn chế trước đây [27, 30, 47, 48, 51]. Các nghiên cứu đã cho thấy gen 56kDa mã hóa cho protein đặc hiệu, đặc biệt với O. tsutsugamushi. Protein này có bốn domain biến thể, có khả năng biến đổi phù hợp với kháng nguyên [69]. Đây là một protein màng ngồi, chứa cả các epitope nhóm đặc hiệu và nằm trên bề mặt của tế bào có liên quan đến sự thâm nhập vào tế bào vật chủ [34, 74]. Hơn nữa theo một nghiên cứu của Cherry Lim và cộng sự, cho thấy độ đặc hiệu của phản ứng PCR trên vùng gen
56kDa cao hơn so với hai vùng còn lại là 47kDa và groEL [36]. Dựa vào một số
nghiên cứu trước đây trình tự mồi và probe đặc hiệu cho O. tsutsugamushi và
Rickettsia lần lượt được chúng tôi thiết kế trên các gen đặc hiệu tương ứng là 56kDa
và gen gltA. Để thiết kế mồi và probe đặc hiệu cho O. tsutsugamushi và Rickettsia
chúng tôi tiến hành thu thập các trình tự tham chiếu của gen 56 kDa và gltA từ
GeneBank, đặc biệt là các trình tự của các chủng ở khu vực Đơng Nam Á, và châu Á. 15 trình tự gen 56 kDa và 54 trình tự gen gltA thu thập từ GenBank được sử
sinh tin như BioEdit, Clone Manager 9. 11 [77]. Vị trí, trình tự mồi và probe được thiết kế thể hiện ở hình 3.1, hình 3.2 và bảng 3.1.