Quá trình phân giải triglyceride tạo ra các axit béo, glycerol, mono – hoặc diglyceride. Chất béo trong sữa của các động vật nhai lại chứa lượng lớn các chuỗi axit béo ngắn và trung bình, khi bị thủy phân chúng đóng góp đáng kể vào việc tạo hương của nhiều loại pho mát. Các axit béo tự do có thể phản ứng với ethanol hoặc các nhóm chứa gốc lưu huỳnh tạo ra các ester hoặc thioester (hình 1.8). Có tới 14 loại ester khác nhau được tìm thấy trong pho mát Emmental, và ester cũng được cho là góp phần vào hương thơm ở pho mát Parmigiano – Reggiano. Các ester phổ biến nhất trong số 38 ester được tìm thấy trong pho mát Parmigiano – Reggiano bao gồm: ethyl butanoate, ethyl hexanoate, ethyl acetate, ethyl octanoate, ethyl decanoate và methyl hexanoate [42, 60].
1.1.4.5. Quá trình phân giải protein
Phân giải protein là q trình phức tạp nhất và có thể là quan trọng nhất trong số các sự kiện sinh hóa diễn ra ở giai đoạn ủ chín pho mát. Quá trình này ảnh hưởng đến sự hình thành hương vị của pho mát theo nhiều hướng khác nhau. Một vài chuỗi peptit ngắn, axit amin tạo hương vị và có thể là cả vị không mong muốn (như vị đắng) cho pho mát (bảng 1.2). Sự phân giải casein làm thay đổi cấu trúc pho mát (làm mềm) tạo điều kiện để giải phóng các hợp chất có vị trong khi nhai. Ngoài ra, q trình này cịn là nguồn cung cấp cơ chất (axit amin) cho một loạt các q trình dị hóa diễn ra sau đó như: sự khử amin, khử cacboxyl, chuyển amin, khử lưu huỳnh [59].
Bảng 1.2: Mô tả vị và ngưỡng giá trị của vị của một số axit amin của pho mát Cheddar (ủ chín 6 tháng) [60] Axit amin Q (cal/mol) Ngưỡng vị (mg/100mL) Nồng độ trong Cheddar (µg/g) Cảm nhận Vị Ngọt Mặn Chua Đắng Umami
Các enzym xúc tác cho quá trình phân giải có thể bắt nguồn từ nhiều nguồn khác nhau: từ tác nhân đơng tụ (chymosin, pepsin hay các proteinase có nguồn gốc từ thực vật hoặc nấm); từ sữa (plasmin, cathepsin D); các chủng khởi động và các chủng tự nhiên có trong sữa; các chủng khởi động thứ cấp gặp ở một số loại pho
mát rắn: Propionibacterium freudenreichii ở pho mát Thụy Sĩ, P. camemberti ở pho mát Camembert và Brie, P. roqueforti ở pho mát Blue [61]. Ngoài ra, các
peptidase hoặc proteinase cũng có thể được bổ sung vào quện sữa để đẩy nhanh q trình chín [29].
Ở hầu hết các loại pho mát, quá trình thủy phân casein ban đầu diễn ra chủ yếu nhờ hoạt động của enzym đơng tụ và một mức độ ít hơn của các plasmin, tạo ra các peptit chuỗi dài và trung bình. Các oligopeptit này được hấp thụ vào tế bào nhờ kênh vận chuyển oligopeptit, di -/tri – peptit [41]. Trong tế bào chất, các peptit bị phân giải nhờ một loạt các enzym nội bào. Các peptidase của LAB được chia thành các endopeptidase, aminopeptidase, di -/tri – peptidase [16, 34]. Sản phẩm cuối cùng của quá trình phân giải protein là các axit amin tự do (FAA). Nồng độ FAA phụ thuộc vào từng loại pho mát và được dùng như là một chỉ số của sự chín [29]. Nồng độ của FAA trong pho mát ở bất kì giai đoạn của q trình chín là kết quả của sự giải phóng các axit amin từ casein và sự chuyển hóa các axit amin thành các sản phẩm khác qua q trình dị hóa. Các axit amin chính ở pho mát Cheddar là glutamate, leucine, arginine, lysine, phenylalanine và serine [70]. Nồng độ của các axit amin thường là tăng lên trong q trình chín, ngoại trừ arginine [63].
Mặc dù một số peptit, axit amin có hương vị đặc trưng như vị đắng, ngọt, malt nhưng nhìn chung chúng chỉ tạo nên hương vị cơ bản của pho mát. Việc tác động nhằm làm tăng quá mức hoạt tính của một vài enzym phân giải protein, cũng như việc thêm các axit amin vào pho mát hầu như khơng ảnh hưởng tích cực đến hương vị của sản phẩm. Sự phân giải protein một cách khơng cân đối có thể dẫn tới sự dư thừa các peptit có vị đắng và do đó, làm giảm hương vị vốn có của pho mát [74].
Hình 1.9: Khái quát các con đường chuyển hóa protein tạo hương ở các sản phẩm sữa lên men [70]
Trong tế bào, hầu hết axit amin bị chuyển hóa thành α – keto axit nhờ enzym aminotransferase. Axit α – Keto là chất trung gian, có thể bị chuyển hóa thành axit hydoroxy, aldehyde hay CoA – ester. Các phản ứng này hầu hết diễn ra nhờ enzym, nhưng cũng có thể xảy ra sự chuyển đổi hóa học như sự hình thành benzaldehyde từ axit phenypyruvic [65]. Các aldehyde có thể bị khử hydro hoặc hydro hóa để tạo thành các chất tương ứng là alcohol và axit hữu cơ. Các hợp chất này là cơ chất cho các enzym esterase và acyltransferase hoạt động, tạo ra các (thio) – ester. Một trong những vai trò sinh học của sự phân giải axit amin là tổng hợp nên các tiền chất, chẳng hạn như cần thiết cho sự tổng hợp sterol và các chuỗi axit béo có nhánh.
Con đường chuyển hóa axit amin quan trọng khác, được bắt đầu bởi enzym lyase như: cystathionine β – lyase có khả năng xúc tác chuyển hóa methionine thành
Ngoại bào Nội bào
Axit amin
methanethiol [23]; threonine aldolase, thuộc lớp enzym lyase khác, có thể chuyển hóa trực tiếp threonine thành acetaldehyde [45].
Các hợp chất có hương tiềm năng nhất trong sơ đồ trên là các aldehyde, alcohol, axit cacboxylic và ester. Trong đó, quan trọng hơn cả là các các aldehyde, alcohol, axit cacboxylic và ester được chuyển hóa từ các axit amin: methionine, phenylalanine, threonine [42].
Bảng 1.3: Các hợp chất hương hình thành từ q trình chuyển hóa axit amin qua axit α – keto theo con đường chuyển hóa transaminase [60]
Axit
amin Axit keto Andehit Axit hữu cơ
Alcohol
(thiol) Este
1.2. Giống khởi động cho sản xuất pho mát
1.2.1. Các nhóm vi khuẩn lactic khởi động trong công nghiệp sản xuất pho mát Giống khởi động cho sản xuất sản phẩm từ sữa là vi sinh vật được chủ động Giống khởi động cho sản xuất sản phẩm từ sữa là vi sinh vật được chủ động bổ sung vào nguyên liệu để tạo ra sản phẩm cuối cùng với các đặc điểm mong muốn, thông qua sự phát triển và quá trình lên men của chúng [64].
Bảng 1.4: Các giống khởi động của một số loại pho mát [17]
STT Loại pho mát Giống khởi động
1 Parmesan, Romano Hỗn hợp Lactobacillus bulgaricus và Streptococcus
thermophilus.
2 Cheddar Lactococcus lactis ssp. lactis; Lc. lactis ssp. cremoris;
Lc. lactis ssp. lactis var. diacetylactis.
3 Swiss, Emmental
Hỗn hợp Lactobacillus bulgaricus (hoặc Lactobacillus lactis hoặc Lactobacillus helveticus) và Streptococcus thermophilus và Propiani bacterium shermanii.
4 Provolone Hỗn hợp các chủng Lactobacillus chịu nhiệt và
STT Loại pho mát Giống khởi động 5 Blue, Gogonzola,
Roquefort, Stilton Lc. lactis ssp. lactis và Penicillium roqueforti. 6 Camembert Lactococcus spp. và Penicillium camembert.
7 Brick, Limburger
Hỗn hợp Streptococcus thermophilus và Lc. lactis ssp. cremoris; Streptococcus thermophilus và
Lactobacillus bulgaricus; Lc. lactis ssp. lactis và Streptococcus thermophilus.
8 Muenster Hỗn hợp Streptococcus thermophilus và các chủng
Lactobacillus.
9 Gouda, Edam Lc. lactis ssp. lactis , Lc. lactis ssp. cremoris,
Leuconostoc.
10 Mozzarella Hỗn hợp các chủng Lactobacillus chịu nhiệt và
Streptococcus thermophilus.
11 Pho mát dạng Cottage, Cream
Lc. lactis ssp. lactis hoặc Lc. lactis ssp. cremoris; Hỗn hợp Lc. lactis ssp. lactis hoặc Lc. lactis ssp. lactis và Lc. lactis ssp. lactis var. diacetylactis. (hay các chủng Leuconostoc).
Trong công nghệ lên men các sản phẩm từ sữa, nhiệm vụ chính của giống khởi động vi sinh vật là : (1)- bảo quản sản phẩm về mặt sinh học, kéo dài thời hạn sử dụng so với nguyên liệu không lên men; (2)- tạo các đặc điểm cảm quan đặc trưng như vị, hương; (3)- tạo cấu trúc đặc trưng cho sản phẩm về độ nhớt, độ cứng, độ thoáng... cũng như màu sắc; (4)- tạo lập các đặc điểm về dinh dưỡng đặc trưng. Giống khởi động trong sản xuất pho mát có thể được chia thành các nhóm sau:
1.2.1.1. Các chủng vi khuẩn lactic ưa ấm
Nhóm LAB ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu ở 30°C, bao gồm các loài
thuộc hai chi, Lactococcus và Leuconostoc. Lactococcus lactis ssp lactis, Lactococcus lactis ssp. cremoris đóng vai trị chính là sinh axit, các loài
Lactococcus lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis, Leuconostoc lactis, Leuconostoc cremoris tạo hương thơm cho pho mát [17].
Các giống khởi động ưa ấm có thể được phân loại thành 4 nhóm sau, dựa trên khả tổng hợp các chất tạo hương cho sản phẩm:
- Loại O: Gồm những chủng khởi động không tạo hương: Lactococcus lactis ssp. lactis và Lactococcus lactis ssp. cremoris.
- Loại D: Gồm các chủng có khả năng lên men citrate – đóng vai trị tạo
hương: Lactococcus lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis.
- Loại B (hoặc L): Chỉ gồm các chủng Leuconostoc có khả năng lên men
citrate để tạo hương.
- Loại BD (hoặc LD): Gồm cả các chủng có khả năng tạo chất thơm như Lc. lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis và các chủng thuộc chi Leuconostoc.
Trong sản xuất pho mát, có thể sử dụng chủng đơn lẻ hoặc kết hợp các chủng với nhau tạo giống khởi động. Trong hỗn hợp giống khởi động thì các chủng sinh axit chiếm ưu thế 90 – 99%, còn các chủng tổng hợp chất hương chỉ chiếm 1 – 10% [15].
Các chủng lactic ưa ấm đã được sử dụng trong sản xuất nhiều loại pho mát khác nhau. Người ta ước tính rằng hai phần ba q trình lên men sữa là sử dụng các chủng ưa ấm. Trong ngành cơng nghiệp sữa liên quan tới q trình lên men, thì các chủng nào càng lên men nhanh thì càng tốt. Đây dường như là một đặc tính ưu thế
của các loài Lactococcus. Các loài khác cũng làm giảm độ pH của sữa nhưng với
tốc độ chậm hơn nhiều [18].
1.2.1.2. Các chủng vi khuẩn lactic ưa nhiệt
Các chủng lactic ưa nhiệt được sử dụng trong sản xuất các loại pho mát cần nhiệt độ nấu cao (Emmental, Gruyere, Grana, Comte). Các LAB ưa nhiệt thuộc hai
chi là Lactobacillus và Streptococcus. Mặc dù Lactobacillus là một nhóm lớn gồm
64 loài nhưng chỉ một vài trong số chúng có khả năng lên men sữa. Các loài
Lactobacillus đã được thương mại hóa chủ yếu là: Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis và Lactobacillus helveticus. Ở chi
Streptococcus, trong số 27 lồi thì chỉ có duy nhất Streptococcus thermophilus được
sử dụng làm giống khởi động trong sản xuất thực phẩm và các sản phầm từ sữa.
1.2.1.3. Các chủng khởi động “thủ công”
Giống khởi động “thủ công” (hay tự nhiên), bắt nguồn từ việc sử dụng một phần sản phẩm của mẻ lên men trước để cấy sang mẻ mới. Một số loại pho mát Ý và Thụy Sĩ, nước sữa (whey) tách ra từ sữa đông của lô sản xuất trước được ủ trong điều kiện chọn lọc như nhiệt độ cao và độ pH thấp để thu nhận whey “khởi động”. Thành phần hệ vi sinh vật của giống khởi động tự nhiên này là rất phức tạp, tương đối biến đổi và thường không xác định. Mặc dù hiệu suất không ổn định, trái ngược với xu hướng hiện nay trong công nghệ tạo chủng khởi động (hiệu suất phải ổn định), việc thay thế bằng những chủng khởi động xác định đôi khi tạo ra sản phẩm ít hương thơm hơn [17].
Trong nhóm này, bên cạnh các chủng khởi động cố hữu cịn có các chủng
thuộc chi Enterococcus thường có mặt với số lượng lớn. Chúng có một số ưu điểm:
sản xuất ra axit nhanh, chịu được nhiệt độ đun sơi, có khả năng thích ứng nhanh với muối. Nhược điểm chính là lồi này có nguồn gốc từ phân và một số chủng được coi là tác nhân gây bệnh. Theo Lopez-Diaz et al.(2000), enterococci đại diện cho các hệ vi sinh vật chiếm ưu thế ở pho mát truyền thống làm từ sữa chưa qua thanh
trùng và nên được sử dụng như chủng khởi động [49]. Enterococcus feacalis đã được sử dụng để thúc đẩy q trình chín của pho mát [17]. Ngồi ra, Enterococcus
cịn ảnh hưởng có lợi đến sự sinh trưởng của lồi LAB khác vì các hoạt động phân giải protein mạnh của chúng [49].
Pediococci không được sử dụng như là chủng khởi động trong bất kỳ sản phẩm sữa nào mặc dù chúng có thể được tìm thấy trong các mẫu pho mát đã ủ chín.
Chỉ có hai lồi Pediococcus pentosaceus và Pediococcus acidilactici được tìm thấy
trong các sản phẩm từ sữa. Gần đây, chủng pediococci có khả năng sử dụng lactose
đã được sử dụng thay thế Streptococcus thermophilus vì các chủng thuộc loài này
1.2.2. Chức năng cần thiết của giống khởi động công nghiệp
Trong công nghiệp sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa nói chung và pho mát nói riêng, điều quan trọng là tạo ra sản phẩm có chất lượng cao và ổn định. Điều này phụ thuộc chủ yếu vào giống khởi động sử dụng. Nhiều nghiên cứu về vai trị và những thuộc tính cần thiết của giống khởi động cho sản xuất pho mát đã được thực hiện [19, 22, 39]. Về cơ bản, giống khởi động trong sản xuất pho mát cần có những đặc điểm: sinh axit, ảnh hưởng tích cực đến sự hình hương thơm, tổng hợp exopolysaccharide, sinh tổng hợp các enzym chuyển hóa protein [17, 27].
1.2.2.1. Sản xuất axit
Sản xuất axit là đặc điểm phổ biến nhất của các chủng lactic khởi động. Chúng chuyển hóa lactose thành axit lactic, kết quả là làm giảm pH của sữa. Sự axit hóa này không chỉ gây ra hiện tượng đông tụ sữa mà còn tăng cường sự tách nước ra khỏi quện sữa trong sản xuất pho mát. Môi trường pH thấp cũng ức chế đáng kể sự phát triển của các vi sinh vật gây hỏng sữa. Ngồi ra, sinh axit cịn ảnh hưởng tích cực đến sự hình thành kết cấu, mùi thơm và vị của pho mát [68]. Các vi khuẩn lactic lên men lactose theo 2 con đường là lên men đồng hình (sản phẩm chính là axit lactic) và lên men dị hình (ngồi axit lactic cịn có các sản phẩm khác như ethanol, axit acetic, CO2).
1.2.2.2. Tổng hợp enzym phân giải protein
Khả năng phân giải protein là hoạt tính cần thiết để cho sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic. Theo Thomas & Mills (1981) [72], hàm lượng peptide và FAA trong sữa chỉ đủ đáp ứng cho 25% sinh khối tế bào khi ni cấy ở điều kiện bình thường. Do đó, đây là đặc tính mà chủng giống khởi động cần có để đảm bảo cho q trình lên men diễn ra ổn định. Sự phân giải protein còn tạo ra các axit amin – là tiền chất cho một loạt các phản ứng tổng hợp nên các hợp chất thơm xảy ra trong q trình ủ chín pho mát. Ngoài ra, hệ enzym của vi khuẩn lactic cũng tham gia vào chuyển hóa các sản phẩm thủy phân protein từ sữa thành các hợp chất có hoạt tính sinh học: tạo các peptit có hoạt tính chống oxy hóa, kích thích hệ miễn dịch, ức chế hoạt động của enzym chuyển angiotensin.
Phức hệ tham gia phân giải protein của LAB gồm 3 hợp phần chính: Các protease gắn vào thành tế bào, làm nhiệm vụ thủy phân casein thành các oligopeptit; các peptidase nội bào, phân giải các peptit chuỗi dài thành các chuỗi peptit ngắn và axit amin; các kênh vận chuyển, cho phép chuyển chuỗi peptit ngắn và axit amin vào tế bào chất.
Khả năng sinh tổng hợp X – prolyl – dipeptidyl aminopeptidase (PepX) cũng là một đặc tính cần thiết của chủng khởi động. PepX là enzym có tác dụng thủy phân chuỗi peptit tại vị trí ngay sau axit amin proline, khi axit amin này nằm ở đầu
N của oligopeptit. Casein của sữa chứa một lượng lớn proline, trong αS1 -, αS2 -, β - và k – casein, axit amin này chiếm tỷ lệ tương ứng là 17%, 10%, 35% và 20% [66].
Proline ảnh hưởng tới cấu trúc không gian của chuỗi peptit chứa proline, làm ngăn cản hoạt động phân giải của các endo – và exo – peptidase đối với các peptit này. Do đó, hoạt tính thủy phân chuỗi peptit chứa proline là một phần thiết yếu trong hệ enzym phân giải protein của chủng khởi động. Trong sản xuất pho mát, PepX có tác dụng làm giảm vị đắng của pho mát, nhờ hoạt tính thủy phân các peptit kị nước. PepX tác dụng đặc hiệu lên casomorphin (là sản phẩm thủy phân khơng hồn tồn từ casein). Casomorphin là peptit thuộc dạng exorphin, có tác dụng lên hệ thần kinh não, gây ra hội chứng tự kỷ, bệnh tim mạch, tiểu đường typ 1 [41]. Enzyme này đã