CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2. Phương pháp điều tra và khảo sát thực tế
Điều tra và khảo sát thực địa, xác định các địa điểm lấy mẫu nước tại các sông, hồ khu vực Hà Nội. Tiến hành lấy 20 điểm tại các sông như sông Tô Lịch, sông Nhuệ, sông Sét, sông Lừ và hồ Tây, hồ n Sở.
Hình 2.1. Sơ đồ vị trí lấy mẫu tại các sông hồ trên khu vực Hà Nội
Bảng 2.1. Vị trí lấy mẫu nƣớc tại các sơng hồ khu vực Hà nội STT Địa điểm lấy
mẫu Labcode mẫu Vị trí Kinh độ Vĩ độ 1 Sông Nhuệ Nh 01 105°46'15.888'' 21°05'00.000'' 2 Nh 02 105°45'41.061'' 21°02'29.496'' 3 Nh 03 105°45'19.446'' 21°00'56.786'' 4 Nh 04 105°47'27.24" 20°57'34.20'' 5 Nh 05 105°48'30.144'' 20°57'07.748'' 6 Nh 06 105°48'12.17'' 20°56'16.86'' 7 Sông Tô Lịch TL 01 105°48'18.78'' 21°02'45.66'' 8 TL 02 105°48'16.61'' 21°00'55.51'' 9 TL 03 105°49'4.71'' 21°00'06.36'' 10 TL 04 105°49'29.92'' 20°58'15.44'' 11 TL 05 105°48'48.06'' 20°57'34.92'' 12 TL 06 105°52'38.65'' 20°57'08.98'' 13 Sông Lừ L 01 105°49'57.31'' 21°00'21.29'' 14 L02 105°49'41.58'' 20°58'24.48'' 15 Sông Sét S 01 105°50'35.46'' 20°59'35.67'' 16 S 02 105°51'12.61'' 20°58'18.82'' 17 Hồ Tây T 01 105°48'55.17'' 21°02'44.90'' 18 Hồ Yên Sở YS 01 105°51'42.58" 20°58'19.81" 19 YS 02 105°51'20.94'' 20°58'10.77'' 20 YS 03 105°51'23.17'' 20°57'45.93'' 2.2.3. Hóa chất và dụng cụ Hóa chất: - Chất chuẩn gốc
+ Chất chuẩn gốc bao gồm hỗn hợp của 13 hợp chất axit perflo- ankylcacboxylic từ C4- C14, C16 và C18 và 4 hợp chất muối perflo-ankylsunfonat bao gồm C4,C6, C8, và C10 có nồng độ 2ppm;
+ Chất nội chuẩn IS là hỗn hợp của 7 hợp chất (13C) của axit perflo- ankylcacboxylic bao gồm C4, C6, C8, C9, C10, C11, C12 và 2 hợp chất muối perflo-ankylsunfonat (18O, 13C) bao gồm C6, C8 có nồng độ 2ppm;
- Nước deion;
- Axit Axetic , 99,9 , Merk, Đức; - Dung dịch ammonia, 25 , Merk, Đức;
- Dung dịch Ammonium acetate (CH3COONH4), 97%; - Dung dịch metanol, Merk, Đức;
- Cột lọc Oasis –WAX cartridge (100 - 200mg) và Oasis-HLB (60 cc- 200mg);
- Muối natri thiosufat(Na2S2O3. 5H2O);
- Giấy lọc thủy tinh (kích thước lỗ màng 0.45 µm, đường kính d.47mm.
Dụng cụ:
- Bộ lọc hút không; - Bộ chiết pha rắn;
- Cân điện tử, độ chính xác 10-4;
- Ống ti m, 50ml (d ng để đổ mẫu vào cartridge); - Ống đong, cốc thủy tinh, ống nghiệm chia vạch PP;
- Vial 1,5 ml, septa trong thành phần không chưa flo hữu cơ.
2.3. Quy trình thí nghiệm
2.3.1. Quy trình lấy mẫu và phân tích hiện trường
Các mẫu nước sông hồ được tiến hành lấytrong hai đợt: mùa khô (tháng 2 2015) và m a mưa (tháng 8 2015) tại sông Nhuệ, sông Tô Lịch, sông Sét, sông Lừ, hồ Tây và hồ Yên Sở. Mỗi đợt lấy 20 mẫu. Các mẫu nước mặt được chứa trong chai nhựa thể tích 500 ml đã được rửa sạch với dung dịch metanol và giữ trong hộp
lạnh trước khi vận chuyển đến phịng thí nghiệm. Quy trình lấy mẫu tn theo tiêu chuẩn TCVN 5992:1995.
Tiến hành đo các thông số hiện trường của mẫu nước bao gồm: nhiệt độ, pH, DO và điều kiện thời tiết trong cả hai đợt lấy mẫu và được trình bày trong chương 3 của luận văn.
Các mẫu sau khi được thu thập về phịng thí nghiệm và bảo quản ở nhiệt độ 4oC, s được tiến hành phân tích theo quy trình phân tích ISO 25101:2009 tại phịng thí nghiệm Hóa mơi trường, Trung tâm Nghiên cứu Công nghệ Môi trường và Phát triển Bền vững, trường Đại học Khoa học Tự Nhiên.
2.3.2. Quy trình phân tích mẫu tại phịng thí nghiệm
Quy trình xử lý mẫu nƣớc bao gồm 4 bƣớc sau:
Bước 1. Lọc mẫu
Mẫu sau khi lấy về được bảo quản ở nhiệt độ 4oC và được xử lý trong 2 tuần. Sau đó lọc mẫu qua màng lọc thủy tinh (đường kính lỗ màng lọc 0,45μm).Trước khi lọc mẫu phải đong chính xác thể tích mẫu.
Màng lọc sau lọc có chứa cặn được ngâm trong 10-15ml MeOH, lắc nhẹ khoảng 5 phút. Phần MeOH đó được đổ vào phần nước đã lọc. Màng lọc thủy tinh được sấy ở 105oC, xác định chất hàm lượng tổng chất rắn lơ lửng TSS.
Với mẫu chứa hơn 500mg L chất rắn lơ lửng, chỉ cho 100ml mẫu qua cột.
Bước 2. Hoạt hóa Cartridge
(Catridge được sử dụng là HL Oasis 6cc 200mg)
Lắp cartridge vào bộ chiết pha rắn, phía trên lắp ống ti m PP 50ml. Sau đó tiến hành rửa cartridge với lần lượt cácdung dịch: 4ml Amoniăc MeOH 0,1%, 4ml MeOH và 4ml nước. Cột không được để khơ ở mỗi lần rửa hóa chất. Và giữ lại một phần nước ở trên cartridge.
Bước 3. Chiết mẫu: Sau khi hoạt hóa catridge tiến hành chiết mẫu:
Thêm 1ml dung dịch nội chuẩn 1ppb đã chuẩn bị vào chai mẫu đã được lọc (500ml mẫu), lắc đều và cho mẫu vào phía trên ống tiêm lắp ở bộ chiết pha rắn, bật chân không, điều chỉnh tốc độ khoảng 1giọt/giây (3-6ml/phút 10ml/phút).
Sau khi mẫu đã chảy hết qua cartridge, tráng chai đựng mẫu ba lần, mỗi lần 5ml nước deion, loại bỏ hết nước qua cột bằng chân không.
Bước 4. Rửa giải
Thêm 4ml dung dịch đệm Acetate được cho vào cartridge đã loại nước, loại bỏ, tiếp tục rửa giải với 4ml MeOH và 4ml Amoniac/MeOH 0,1% (tốc độ rửa giải 1 giọt/giây). Mẫu được hứng vào ống nghiệm và đem cô cạn về 1ml bằng khí N2
Lọc lại mẫu sau khi rửa giải để loại bỏ các tạp chất và đem phân tích trên thiết bị sắc ký lỏng ghép nối khối phổ LC-MS/MS.
Quy trình phân tích mẫu được tóm tắt trong sơ đồ sau:
2.4. Thiết bị phân tích
2.4.1. Nguyên lý hoạt động của thiết bị phân tích LC-MS/MS
Thiết bị phân tích Sắc ký lỏng ghép nối khối phổ: LC-MS/MS là sự kết hợp giữa khả năng tách tách của thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và khả năng
Lọc mẫu Sử dụng màng lọc sợi thủy tinh (Ø= 0,45µm) Phân tích trên LC-MS/MS Rửa giải - Với 4ml MeOH
- Tiếp với 4ml Amoniac/MeOH 0,1%
Ammonia/MeOH
Chiết mẫu
Sử dụng cột chiết pha rắn đã hoạt hóa, tốc độ: 1 giot/giây
Mẫu nƣớc mặt
Hoạt hóa cột chiết pha rắn với: - 4 ml Amoniac/MeOH 0,1% - 4ml MeOH - 4ml H2O Phần nước khơng có cặn lơ lửng Cặn lơ lửng bám trên màng lọc Thêm 10ml MeoH, ngâm và lắc nhẹ trong 15 phút MeOH Thêm 1ml chất chuẩn PFCsvào hỗn hợp dung dịch
Cô cạn dung dịch mẫu về 1ml
phát hiện của detectơ khối phổ (MS). Đây là một kỹ thuật phân tích với độ nhạy và tính chọn lọc rất cao, cho phép người phân tích nhận diện và định lượng từng cấu tử trong mẫu thông qua các dung dịch chuẩn và sắc đồ tương ứng [14,21].
Hình 2.3. Sơ đồ cấu tạo thiết bị LC-MS/MS
Thành phần cơ bản của hệ thống LC-MS/MS bao gồm 3 bộ phận chính: (1) Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao, (2)detectơ khối phổ, (3)hệ thống nhận dữ liệu (máy tính).
Hệ thống sắc ký lỏng hiểu năng cao (HPLC):
Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn). Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc
Dung môi Cổng bơm mẫu
Cột sắc ký
Bộ phận Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Bộ phận Khối phổ
Truy xuất dữ liệu Bơm
phân tử và tính chất lí hố của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.
Trong HPLC, pha tĩnh chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích. Đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ 3 – 7mm, cịn pha động trong HPLC đóng góp một phần rất quan trọng trong việc tách các chất phân tích trong q trình sắc ký nhất định. Mỗi loại sắc ký đều có pha động rửa giải riêng cho nó để có được hiệu quả tách tốt.
Các cấu tử trong mẫu tách ra khỏi nhau đi ra khỏi cột với tốc độ khác nhau và thời gian khác nhau, chuyển sang detectơ khối phổ [14].
Detectơ khối phổ (MS)
Phương pháp khối phổ (MS) là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc từ trường nhất định. Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion. Nếu biết được điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó.
Nếu như MS chỉ đo m z của một hợp chất thì MS MS đo m z của hợp chất đó c ng với những hợp chất trung gian. MS/MS lọc các hợp chất đặc trưng sau đó phá vỡ thành các hợp chất trung gian nhỏ hơn, sau đó lại lọc các chất trung gian đó và phát hiện những chất con đặc trưng. Điều này s tạo sự chính xác và độ nhạy cao hơn.
2.4.2. Điều kiện phân tích của thiết bị LC-MS/MS 8040, Shimadzu
Các mẫu nước sau khi đã được xử lý tại phịng thí nghiệm hóa mơi trường, Trung tâm Nghiên cứu Công nghệ môi trường và Phát triển bền vững được phân tích bằng thiết bị sắc ký lỏng ghép nối hai lần khối phổ LC-MS/MS 8040, Shimadzu trong cùng phịng thí nghiệm của Trung tâm.
Điều kiện phân tích của thiết bị LC-MS MS 8040 được thể hiện chi tiết như sau:
Tiền cột: C30-UG-5 (4.0 mm I.D. × 35 mm L.)
Pha động A: Dung dịch amoniacetat 2mM : dung dịch metanol = 9:1
Pha động B: Metanol
Chương trình dung mơi: 30 B (2,01ph t) - 95 %B (18 phút) - 95 %B (22 phút) – 30% (22,1-25 phút). Tốc độ dòng: 0.3 mL/phút Thể tích bơm mẫu: 5μL Nhiệt độ cột: 40°C Tốc độ d ng khí phun sương: 3 L ph t Tốc độ khí làm khơ: 15 L/phút Nhiệt độ thanh DL: 250°C
Bảng 2.2. Thông số phân tích của các hợp chất PFCs bằng thiết bịLC-MS/MS STT Hợp chất Ion mẹ Ion sản phẩm Thế Q1 (V) Thế CE (V) Thế Q3 (V) 1 PFHxA 313,00 268,90 15 10 27 2 PFHpA 363,00 318,85 17 10 20 3 PFOA 412,80 368,85 15 11 24 4 PFNA 462,80 418,85 13 11 28 5 PFDA 512,80 468,85 30 12 30 6 PFUnDA 562,80 518,85 20 12 36 7 PFDoDA 612,80 568,85 22 14 38 8 PFTrDA 662,80 618,85 24 15 40 9 PFTeDA 712,80 668,80 26 16 30 10 PFBS 299,00 98,95 14 31 17 11 PFHxS 398,80 98,95 15 37 17 12 PFOS 498,80 99,00 18 44 17 13 PFDS 598,80 98,90 20 55 16 14 C4-PFOA 416,80 317,90 15 12 25 15 C4-PFOS 502,80 98,90 38 46 17
2.5. Phương pháp đánh giá nguy cơ rủi ro tới hệ thủy sinh vật
Trong phạm vi nghiên cứu, luận văn sử dụng phương pháp đánh giá nguy cơ rủi ro của PFCs lên hệ thủy sinh vật là phương pháp sinh trắc: tổng hợp đáp ứng của các sinh vật nước đối với chất ô nhiễm PFCs.
Trong số các hợp chất PFCs, chỉ riêng có hợp chất PFOS được thêm vào phụ lục B của công ước Stockholm về các hợp chất hữu cơ ơ nhiễm khó phân hủy, và PFOS được tìm thấy phổ biến nhất trong các mẫu môi trường, hợp chất này xuất hiện đặc biệt phổ biến trong các mô của sinh vật nước. Nên các nghiên cứu về mức độ độc tính của các hợp chất PFCs chủ yếu tập trung vào hợp chất PFOS. Trong những năm gần đây, c ng có một số nghiên cứu về độc tính mãn tính và độc độc cấp tính của PFOS trong các sinh vật thủy sinh để. Vì vậy, luận văn tập trung nghiên cứu tới nguy cơ rủi ro do PFOS gây ra cho hệ thủy sinh vật.
Dựa trên công thức xác định độ rủi ro:
RQ= MEC (PEC)/PNEC [4] Trong đó:
RQ: Hệ số rủi ro
MEC:nồng độ chất trong môi trường được xác định bằng đo đạc PEC: Nồng độ chất mơi trường dự báo qua tính tốn
PNEC: là nồng độ dự báo ngưỡng (là nồng độ không gây tác động lên đối tượng
([4]: Công thức tính hệ số rủi ro trong tài liệu [4]: Đánh giá rủi ro môi trường của TS. Lê Thị Hồng Trân)
Các giá trị PNEC được ước tính từ phép đo độ độc cấp tính hoặc mãn tính đối với các lồi khác nhau trong các thử nghiệm độc tính trong phịng thí nghiệm.
Với các cấp độ rủi ro được xem xét như sau:
RQ từ 0,01 đến 0,1: Rủi ro thấp RQ từ 0,1 đến 1: Rủi ro trung bình
Trong nghiên cứu này, tơi sử dụng các giá trị độc tính do PFOS gây ra đối với hệ thủy sinh vật của Cơ quan bảo vệ mội trường Mỹ (EPA) [19,21] làm tiêu chuẩn để đánh giá nguy cơ rủi ro do PFOS tới hệ thủy sinh vật. Ở đây, EPA tiến hành thử nghiệm trên ba loài thủy sinh vật là: cá (cá chép nước ngọt), động vật không xương sống (nhện nước)và tảo (tảo xanh). Cơ quan bảo bệ Môi trường Mỹ (EPA) đã tiến hành nghiên cứu các giá trị LC50/EC50 làm cơ sở căn cứ xác định độ độc cấp tính và giá trị NOEC làm cơ sở căn cứ xác định độ độc mãn tính [19,21].
Các giá trị LC50/EC50 và NOEC được xác định qua việc nghiên cứu độ độc gây ra cho ba loài sinh vật bởi hợp chất PFOS do EPA nghiên cứu được thể hiện qua bảng 2.3.
Bảng 2.3. Bảng tóm tắt giá trị độc tính do PFOS gây ra đối với hệ thủy sinh vật
Độc tính cấp tính
Cá Cá chép nước ngọt (96h): LC50= 4,7mg/L Động vật không
xương sống
Loài giáp xác (Nhện nước) (48h): EC50= 27mg/L Tảo Tảo lục (96h): EC50= 126mg/L Độc tính mãn tính Cá Cá chép nước ngọt (42 ngày): NOEC = 0,3mg/L Động vật không xương sống
Nhện nước( 28 ngày): NOEC =7mg/L
Tảo Tảo lục (96 h): NOEC= 44mg/L
(Theo Cơ quan bảo vệ môi trường của Mỹ, EPA)[21] Tính tốn giá trị PNEC:
Các giá trị PNEC có thể được ước lượng từ dữ liệu độc tính của PFOS gây ra cho sinh vật, bao gồm các giá trị LC50/EC50 và NOEC xem xét cho độ độc cấp tính và độ độc mãn tính đối với các lồi thủy sinh trên, giá trị PNECs có thể được tính tốn bằng cách ngoại suy từ sự khác biệt giữa các đối tượng nghiên cứu so với thực tế. Bên cạnh đó các sinh vật thủy sinh mà EPA nghiên cứu bao gồm: cá chép nước ngọt, nhện nước, tảo lục là đại diện cho các lồi :cá, động vật khơng xương sống và
tảo, đây c ng là các sinh vật thủy sinh phổ biến ở Việt Nam được tìm thấy hầu hết tại các sông hồ trên cả nước, có điều kiện mơi trường sống thích hợp với khí hậu nhiệt đới của nước n n coi như khơng có sự sai khác giữa các đối tượng mà EPA nghiên cứu so với các sinh vật thủy sinh ở Việt Nam.
Giá trị PNEC được tính tốn bằng thương số của các giá trị LC50/EC50 hoặc NOEC cho hệ số đánh giá AF (Assessement factor). Hệ số đánh giá AF =10n, giá trị n= 1,2,3...n. Với mỗi một sự thay đổi về loài sinh vật thử nghiệm, về dữ liệu độ độc,... thì giá trị n s tăng th m 1 đơn vị. Ở đây, luận văn tham khảo giá trị hệ số đánh giá AF để ước tính giá trị PNEC của Cơ quan bảo vệ mơi trường Mỹ.
Bảng tóm tắt các hệ số đánh giá để ƣớc tính giá trị PNEC
Dữ liệu Khoảng giá trị AF
Dữ liệu độ độc cấp tính LC50 (cá chép - 96h) EC50 (nhện nước - 48h) EC50 (tảo lục - 96h) 100 - 1000 Dữ liệu độ độc mãn tính NOEC (cá chép - 42 ngày) NOEC (nhện nước - 28 ngày) NOEC (tảo lục - 96h)
10 - 100
(Theo Cơ quan bảo vệ môi trường của Mỹ, EPA)[21]
Luận văn lựa chọn giá trị AF để ước tính giá trị PNEC từ các giá trị
LC50/EC50 là 1000, và giá trị AF để ước tính giá trị PNEC từ giá trị NOEC là 100. Từ các giá trị AF có được, luận văn tính tốn được các giá trị PNEC cho dữ liệu độ độc cấp tính và độ độc mãn tính gây ra cho ba loài sinh vật bởi hợp chất PFOS, được trình bày trong bảng 2.4.
Tại đây giá trị PNEC cho mỗi loài xem xét cho độ độc cấp tính và độ độc mãn tính được tính tốn từ các giá trị LC50/EC50, NOEC tương ứng của mỗi loài.
Bảng 2. 4 Giá trị PNEC của một số loài sinh vật thủy sinh PNEC (mg/L) PNEC (ng/L)