Trình tự ACGCT CGGAT GCCAC TACAG GGTTG CATGC
CGTGG GGAGG GGGGT GGGTT TTATA GCGTA CTCAG CTCAT GGACG TGCTG GTGAC 5‟-(CH2)6 -SH
2.3.2. Quy trình sử dụng hạt nano Fe3O4@Ag đính kết aptamer để phát hiện tế bào ung thƣ phổi A549 bào ung thƣ phổi A549
Tế bào ung thư phổi A549 được nhận từ phòng Nano sinh học, khoa Sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên. Tế bào A549 được bảo quản trong ống Penicilin sạch ở 4oC. Lấy 50.10-3 mg phức hệ Fe3O4@Ag-Aptamer (MF-Apt) vào trong effpendorf có chứa sẵn tế bào A549 trong dung mơi PBS. Sau đó rung siêu âm trong 15 phút và đem ủ ở 37oC trong 30 phút. Lọc rửa bằng từ trường lấy được phức hệ Fe3O4@Ag-aptamer-A549 để đem đi chụp ảnh trường sáng-trường tối nhằm kiểm tra sự bắt cặp với tế bào A549 của hệ hạt nano Fe3O4@Ag-aptamer.
2.4. Các phƣơng pháp khảo sát cấu trúc, hình thái và tính chất của vật liệu nano 2.4.1. Nhiễu xạ tia X (XRD) 2.4.1. Nhiễu xạ tia X (XRD)
Tia X có bước sóng từ 0,5 Å đến 2,5 Å được sử dụng trong phép phân tích nhiễu xạ tia X do bước sóng này có độ lớn vào cỡ bán kính nguyên tử, cỡ kích thước các ion và khoảng cách giữa các nguyên tử trong mạng tinh thể. Năng lượng của các photon tia X vào cỡ năng lượng cần để ion hóa các electron ở lớp điện tử sâu bên trong của nguyên tử; do có năng lượng cao, tia X có khả năng xuyên sâu mạnh đồng thời ít bị khúc xạ khi đi qua vật chất. Những lí do trên giúp cho phổ nhiễu xạ tia X được coi như bằng chứng trực tiếp phản ánh cấu trúc tinh thể của nguyên tử.
Năm 1913, W. L. Bragg đã đưa ra định luật mang tên ơng để giải thích hiện tượng nhiễu xạ trên tinh thể. Gọi d là khoảng cách giữa các mặt phẳng mạng song song. Sóng tới X sẽ bị phản xạ trên các mặt phẳng này, các sóng phản xạ sau đó giao thoa với nhau. Gọi 𝜃 là góc tới và góc phản xạ. Để hai sóng phản xạ này cùng pha với nhau, tức là sự giao thoa xảy ra giữa hai sóng tăng cường lẫn nhau và cường độ chùm tia nhiễu xạ sẽ đạt cực đại thì cần thỏa mãn hệ thức (2.1). Trong đó n là bậc phản xạ (n = 1, 2, 3,…), 𝜆 là độ lớn của bước sóng tia X tới. Điều kiện này được gọi là điều kiện phản xạ Bragg.
Hình 2.4. Phản xạ Bragg từ các mặt phẳng mạng song song trong nhiễu xạ
tia X.
Bằng cách phân tích phổ nhiễu xạ tia X ta có thể xác định hệ mặt phẳng mạng, khoảng cách dhkl giữa hai mặt phẳng mạng gần nhau nhất. Từ giá trị dhkl ta lại xác định được hẳng số mạng (kích thước của ơ cơ sở của mạng tinh thể) thông qua các chỉ sổ Miller (hkl).
Với tinh thể lập phương
𝑑ℎ𝑘𝑙 = 𝑎
ℎ2 +𝑘2 +𝑙2 1/2 (2.2)
Ngoài ra căn cứ vào sự mở rộng vạch, ta có thể xác định kích thước của hạt thơng qua cơng thức Scherrer
𝐷 = 0,9𝜆
𝛽𝑐𝑜𝑠𝜃 (2.3)
Trong đó D là kích thước hạt, 𝛽 là độ rộng bán cực đại của vạch
Vậy, phổ nhiễu xạ tia X có vai trị rất quan trọng trong phân tích cấu trúc vật liệu, nó cho phép phát hiện các pha tinh thể nhỏ (có nồng độ nhỏ hơn 1%); Xác định kích thước tinh thể của vật liệu đa tinh thể; Xác định tỉ lệ phần trăm vật liệu dưới dạng vơ định hình. Phép đo nhiễu xạ tia X thực hiện trên máy Bruker – AXS D5005 của hãng Siemens tại Trung tâm Khoa học Vật liệu, khoa Vật lý, trường ĐHKHTN, Đại học Quốc gia Hà Nội. Chế độ làm việc của ống tia X sử dụng bức xạ Cu-Kα1 có bước sóng 1,54056 Å. Mẫu được sấy khô thành dạng bột, lưu trong ống eppendorf sau đó được gửi đi khảo sát phổ XRD.
2.4.2. Hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscope) là một thiết bị nghiên cứu vi cấu trúc vật rắn, sử dụng chùm điện tử có năng lượng cao, vận tốc lớn chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng cần đo và sử dụng thấu kính từ để tạo ảnh có độ phóng đại lớn, ảnh có thể tạo ra trên màn huỳnh quang, trên phim quang học hay ghi nhận bằng các máy chụp kĩ thuật số.
Cơ sở hoạt động của kính hiển vi điện tử truyền qua cũng tương tự như hiện tượng nhiễu xạ tia X, chỉ khác ở đây là nhiễu xạ chùm điện tử. Kính hiển vi điện tử truyền qua có cấu trúc tương tự kính hiển vi điện tử quang học trong đó thay ánh sáng bằng chùm điện tử năng lượng cao và thay hệ thống thấu kính hội tụ bằng từ trường nên có độ phân giải cao gấp vài ngàn lần kính hiển vi quang học do bước sóng chùm điện tử nhỏ hơn rất nhiều bước sóng của ánh sáng khả kiến. Kính hiển vi điện tử truyền qua có thể nghiên cứu các đối tượng cỡ vài Angstrom như kích thước tế bào, vật liệu kích thước dưới nguyên tử. Do đó nó có ứng dụng quan trọng trong y học, sinh học và khoa học vật liệu.
Hình 2.5. Hệ đo hiển vi điện tử truyền qua TEM.
Phép đo kính hiển vi điện tử truyền qua được đo trên hệ máy hiển vi JEOL JEM1010 đặt tại Viện Vệ sinh Dịch tễ TW, số 1 Yecxanh, Hai Bà trưng, Hà Nội. Mẫu được phân tán đều trong dung môi nước khử ion với nồng độ vừa đủ, lưu mẫu trong ống eppendorf, rung siêu âm 30 - 40 phút trước khi gửi mẫu khảo sát.
2.4.3. Tán sắc năng lƣợng tia X (EDS)
Phổ tán sắc năng lượng tia X (Energy Dispersive X-ray Spectroscopy) thường viết tắt là EDX hoặc EDS là kĩ thuật phân tích thành phần hóa học của vật rắn dựa vào phổ tia X thu được khi các điện tử tương tác với vật rắn. Khi chiếu một chùm điện tử có năng lượng cao (được tăng tốc bởi một điện thế giữa hai điện cực UAK) tới đập vào bề mặt vật rắn, tại đây điện tử bị hoãn đột ngột và phát ra tia X.
Mỗi một loại vật chất khác nhau sẽ có các phổ đặc trưng tia X nhất định. Phổ đặc trưng xuất hiện khi các electron có năng lượng đủ lớn tới làm bật các electron sâu bên trong nguyên tử của mẫu, nguyên tử khi đó ở trạng thái kích thích. Khi trở lại trạng thái cân bằng sẽ phát ra tia X có bước sóng đặc trưng của nó.
Cường độ phổ đặc trưng được xác định là
𝐼 =𝑘.𝑖. 𝑉 − 𝑉𝑜 𝑛 (2.4)
Trong đó Vo là hiệu điện thế tới hạn kích thích để phát ra tia X có bước sóng đặc trưng; n phụ thuộc vào số dãy của nguyên tử; k là hệ số tỉ lệ; i là cường độ dịng điện tử tới. Bước sóng tia X thu được tỉ lệ với số hiệu nguyên tử của mỗi nguyên tố hóa học hay tia X phát ra bởi các ngun tử bị kích thích có liên quan chặt chẽ tới cấu trúc nguyên tử và nồng độ các ngun tố, do đó việc phân tích phổ tia X giúp ta đồng thời xác định các thành phần và tỉ lệ khối lượng các nguyên tố có trong mẫu. Tia X phát ra có năng lượng biến thiên trong dải rộng được đưa đến hệ tán sắc và ghi nhận năng lượng nhờ vào Detector dịch chuyển.
Phép đo này, chúng tôi thực hiện trên máy JSM 5410LV tại Trung tâm Khoa học Vật liệu, khoa Vật lý, trường ĐHKHTN, Đại học Quốc Gia Hà Nội. Mẫu được sấy khô ở dạng bột, lưu trong ống eppendorf sau đó được gửi đi khảo sát phổ EDS.
2.4.4. Phổ hấp thụ tử ngoại – khả kiến (UV-Vis)
Phương pháp đo phổ hấp thụ tử ngoại - khả kiến UV-vis (Ultravolet–vis Spectroscopy) là phương pháp thông thường để xác định thành phần của dung dịch một cách đơn giản và nhanh chóng thơng qua sự hấp thụ ánh sáng của vật liệu.
Hình 2.6. Sơ đồ mơ tả sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch.
Phép đo phổ hấp thụ tử ngoại – khả kiến dựa trên định luật Beer – Lambert. Khi chiếu một chùm tia sáng đơn sắc có cường độ Io đi qua một mơi trường vật chất thì cường độ của tia sáng ban đầu sẽ giảm còn I. Gọi T là độ truyền qua T = 𝐼
𝐼𝑜; A là độ hấp thụ A = 𝐼𝑜−𝐼
𝐼𝑜 . Biểu thức của định luật Lambert - Beer 𝐴 =𝑙𝑔 𝐼𝑜
𝐼 = 𝜀.𝐶.𝑙 (2.5)
Trong đó C là nồng độ dung dịch mol/l hoặc %; 𝑙 là chiều dài truyền; 𝜀 là hệ số hấp thụ đặc trưng cho phân tử, phụ thuộc vào bước sóng tới. Hai đại lượng đặc trưng cho phổ hấp thụ là vị trí cực đại hấp thụ λmax và cường độ hấp thụ.Phép đo này được thực hiện tại bằng máy UV-2450PC tại Trung tâm Khoa học Vật liệu – khoa Vật lý – trường ĐHKHTN, Đại học Quốc gia Hà Nội
2.4.5. Phổ biến đổi Fourier hồng ngoại (FTIR)
Phổ biến đổi Fourier hồng ngoại (Fourier Transform Infrared Spectroscopy – FTIR) cũng có nguyên tắc hoạt động dựa trên sự suy giảm cường độ ánh sáng khi đi qua một môi trường vật chất và cũng tuân theo định luật Lambert – Beer giống như phổ hấp thụ UV-vis. Nguyên tắc cụ thể như sau: khi chiếu một chùm tia sáng đơn sắc nằm trong vùng hồng ngoại (4000 - 400 cm-1) đi qua mơi trường vật chất (mẫu cần phân tích) thì cường độ của chùm tia sáng bị suy giảm tuân theo định luật Lambert – Beer. I Mẫu l I o I R I A
Phổ hấp thụ hồng ngoại là phổ hấp thụ thu được do kết quả của sự quay và dao động của phân tử, nguyên tử khi có bức xạ chiếu tới. Khi hấp thụ năng lượng từ các bức xạ bên ngoài, chuyển động quay, dao động (giãn đối xứng, giãn bất đối xứng, uốn cong mặt phẳng, uốn ngoài mặt phẳng) hoặc kích thích nguyên tử của phân tử sẽ bị kích thích, hiện tượng cộng hưởng spin electron, cộng hưởng từ hạt nhân của nguyên tử thay đổi. Mỗi một hợp chất hóa học sẽ hấp thụ năng lượng hồng ngoại ở một tần số đặc trưng khi thỏa mãn đồng thời hai điều kiện sau: (i) Tần số dao động riêng của phân tử bằng tần số dao động của bức xạ tới; (ii) Sự dao động của các phân tử phải dẫn tới sự thay đổi momen lưỡng cực của chúng.
Khi tần số dao động của một nhóm nguyên tử trong phân tử ít phụ thuộc hoặc khơng phụ thuộc vào các ngun tử cịn lại trong phân tử thì tần số ấy được gọi là tần số đặc trưng của nhóm hay tần số nhóm. Dựa vào tần số đặc trưng và cường độ đỉnh trong phổ hấp thụ thu được ta sẽ xác định được sự có mặt của các nhóm chức và liên kết trong phân tử hữu cơ cần nghiên cứu như C-C, C=C, C≡C, C-H, C-O, C=O, C-N, O-H, N-H, …
Hình 2.7. Hệ máy đo phổ biến đổi Fourier hồng ngoại tại khoa Hóa học, trường ĐHKHTN.
Phép đo này được thực hiện trên hệ thống đo phổ hấp thụ hồng ngoại FTIR – 8400S Shimadzu – Japan tại Khoa Hóa, trường ĐHKHTN – Đại học Quốc gia Hà Nội số 19 Lê Thánh Tơng – Phan Chu Trinh – Hồn Kiếm – Hà Nội.
2.4.6. Hệ đo từ kế mẫu rung (VSM)
Hệ đo từ kế mẫu rung (Vibrating Sample Magnetometer – VSM) là một thiết bị đo cho biết tính chất từ của vật liệu, hoạt động dựa trên hiện tượng cảm ứng điện từ khi vật liệu được rung trong một từ trường. Khi mẫu rung và đặt trong từ trường thì từ trường do mẫu sinh ra sẽ sinh ra từ thông biến thiên. Từ thông đi qua cuộn dây thu tín hiệu biến thiên sẽ sinh ra suất điện động cảm ứng V(t). Suất điện động cảm ứng này tỉ lệ với số vòng dây và Gradient từ trường H đặt vào. Điện thế xoay chiều sinh ra được đi qua bộ khuếch đại trước khi đi tới bộ xử lý tín hiệu. Kết quả ta thu được đường cong từ trễ, từ hóa M(H) biểu thị mối liên hệ giữa cường độ từ trường H bên ngồi và momen từ M. Phân tích đồ thị này ta thu được các thơng tin và tính chất từ của vật liệu cần nghiên cứu.
Phép đo hệ từ kế mẫu rung được thực hiện trên máy DMS 880 của hãng Digital Measurement Systems (Mỹ) với từ trường cực đại là 13,5 kOe tại Trung tâm Khoa học Vật liệu, ĐHKHTN. Sấy khô mẫu thành dạng bột, cho vào giấy bạc đựng mẫu rồi tiến hành cân sao cho khối lượng mẫu gần bằng nhau và dao động từ 3-7 mg. Ghi lại giá trị khối lượng cụ thể của từng mẫu đo và gửi đi khảo sát độ từ hóa.
2.4.7. Tán xạ Raman (Raman Scattering – RS)
Tán xạ Raman là một quá trình tán xạ giữa photon (lượng tử ánh sáng) và một lượng tử dao động của vật chất hay mạng tinh thể. Sau quá trình va chạm, năng lượng của photon giảm đi (hoặc tăng lên) một lượng bằng năng lượng giữa hai mức dao động của nguyên tử (hoặc mạng tinh thể) cùng với sự tạo thành (hoặc hủy) một hạt lượng tử dao động. Mẫu cần nghiên cứu được chiếu bằng chùm Laser có cường độ mạnh trong vùng tử ngoại và khả kiến, chùm ánh sáng tán xạ được quan sát theo phương vng góc với chùm bức xạ tới. Ánh sáng tán xạ bao gồm:
+ Tán xạ Rayleigh rất mạnh. Hầu hết các nguyên tử, phân tử sau khi tương tác với sóng điện từ sẽ phát ra bức xạ có tần số bằng đúng với tần số dao động tới.
+ Tán xạ Raman rất yếu. Các bức xạ phát ra có tần số 𝑣 =𝑣𝑜 ± 𝑣𝑡 (𝑣𝑡 là tần số dao động của phân tử). Đây là q trình tán xạ khơng đàn hồi. Sự phân cực này làm cho tần số phân tách thành hai loại tán xạ: Tán xạ Stockes có 𝑣𝑆 =𝑣𝑜 − 𝑣𝑡 và
Tán xạ phản Stockes 𝑣𝐴𝑆 =𝑣𝑜 +𝑣𝑡. Sự dịch chuyển của các vạch này so với vạch Rayleigh đặc trưng cho từng môi trường vật chất và không phụ thuộc vào tần số ánh sáng tới.
Mẫu được khảo sát phổ Raman bằng hệ máy Model LabRAM HR, hãng HORIBA Jobin Yvon tại Trung tâm Khoa học Vật liệu, ĐHKHTN, Đại học Quốc gia Hà Nội. Mẫu được nhỏ lên đế lamen sạch, để khô tự nhiên rồi mang đi khảo sát phổ tán xạ Raman.
Hình 2.8. Sơ đồ mơ tả ánh sáng tán xạ Raman.
2.4.8. Chụp ảnh hiển vi trƣờng sáng – trƣờng tối (Dark Field Microscopy)
Mẫu khảo sát có dạng dung dịch. Dùng Pipet lấy 10 μl mẫu nhỏ lên lam kính đã được rửa sạch và sấy khô. Lấy một tấm lamen sạch đặt lên khu vực mẫu vừa nhỏ để mẫu phân bố đều trên lam kính, sau đó để vào giá đựng mẫu vật của kính hiển vi quang học và tiến hành chụp ảnh hiển vi trường sáng - trường tối của mẫu. Sử dụng độ phóng đại của vật kính là 200 lần. Ảnh hiển vi trường sáng – trường tối được thực hiện trên hệ kính hiển vi Axioplan2 của hãng Carl Zeiss tại khoa Sinh học – ĐHKHTN, Đại học Quốc gia Hà Nội
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Trong chương này, các kết quả khảo sát cấu trúc, thành phần, hình thái, tính chất từ và tính chất quang … của các hệ mẫu chế tạo được, phổ biến đổi Fourier hồng ngoại, phổ tán xạ Raman của hệ “hạt nano – aptamer” và ảnh hiển vi trường sáng-trường tối của hệ “hạt nano-aptamer-tế bào A549” sẽ được trình bày. Các kết quả cho thấy, các hạt nano Ag đã hình thành trên bề mặt hạt nano Fe3O4@SiO2- NH2, tạo thành hạt nano đa chức năng Fe3O4@Ag, aptamer đã được đính kết trên bề mặt hạt nano và đã có sự bắt cặp của tế bào A549 với hệ hạt nano đang khảo sát cho thấy khả năng ứng dụng của hạt nano đa chức năng này vào trong phát hiện, đánh dấu, tách chiết trong y sinh. Đồng thời khảo sát sự hình thành lớp vỏ Ag khi thay đổi thời gian chức năng hóa hạt nano Fe3O4@SiO2 với APTES.
3.1. Hạt nano từ Fe3O4, hạt nano Fe3O4@SiO2 và hạt nano đa chức năng Fe3O4@Ag Fe3O4@Ag
3.1.1. Phổ biến đổi Fourie hồng ngoại của vật liệu nano
Hình 3.1. Phổ hấp thụ hồng ngoại Fourier của hạt nano Fe3O4, Fe3O4@SiO2 và Fe3O4@SiO2-NH2 ở các số sóng khác nhau.
Hình 3.1 thể hiện phổ FTIR của các hạt nano Fe3O4, Fe3O4@SiO2 và Fe3O4@SiO2-NH2 được khảo sát trong dải phổ từ 300 – 1500 cm-1 và dải phổ từ