CHƢƠNG 2 : ĐỀ TÀI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM
2.3. THỰC NGHIỆM
2.3.7. Phân lập và xác định cấu trúc phân tử của các chất trong các cặn chiết
Để phân lập các chất từ cặn chiết etyl axetat chúng tơi sử dụng phương pháp sắc kí cột .
a) Chuẩn bị mẫu chất phân tách:
Hòa 2 gam cặn chiết từ etyl axetat ( cặn E) vào một lượng EtOAc đủ để tan hết, cho thêm 3 gam silica gel cỡ hạt 40-60 m, trộn kỹ, làm khô hết dung môi.
b) Chuẩn bị cột:
Cột thủy tinh có = 3 cm, l = 70 cm, có khố và nút thuỷ tinh ở đầu và cuối cột được rửa sạch bằng axit sunfocromic, nước, axeton, sấy khô. Cho 170g silica gel cỡ hạt 40 – 60 m vào 200 ml n- hexan, khuấy đều và đổ vào cột, gõ cột đến khi không
Mở khóa để dung mơi trong cột xuống ngang mặt chất hấp phụ, cho hỗn hợp chất phân tách đã chuẩn bị (phần a) lên cột rồi cho dung môi rửa cột đến ngập chất, xử lí để loại bỏ hết bọt khí, cho một lớp bơng Silica gel mỏng để giữ yên bề mặt cột.
Rửa cột bằng hệ dung môi n-hexan/EtOAc tỉ lệ 7/3 theo thể tích với tốc độ 20
giọt /phút và lấy thành các phân đoạn, mỗi phân đoạn 6 ml. Kiểm tra các phân đoạn bằng SKLM và thu gom các phân đoạn chỉ cho một vệt giống hệt nhau, về Rf và màu sắc phổ với cả 2 thuốc thử vanilin/H2SO4 1% và FeCl3 1M (pH 4), các phân đoạn có thành phần giống nhau được gộp lại với nhau và đem cất đuổi dung môi để thu chất. - Với các phân đoạn chỉ cho một vệt chất được coi là chất sạch, nếu là chất rắn thì kết tinh lại để thu được chất tinh khiết, nếu là chất lỏng thì cất lại để thu chất tinh khiết. - Với các phân đoạn có 1 – 3 vệt và ∆Rf nhỏ thì khảo sát lại bằng SKLM để tìm hệ dung mơi thích hợp và tiến hành sắc kí cột lại để phân lập các chất tinh khiết. Bằng cách này, chúng tơi đã tiến hành thí nghiệm và được kết quả như sau:
Từ phân đoạn 128 đến phân đoạn 160 thu được một vệt tinh khiết, cô đuổi dung môi được chất rắn kí hiệu là P5, khối lượng 0,30 g, Rf = 0,79 (hệ dung môi n- hexan/EtOAc tỉ lệ thể tích 3/7) hiện màu tím với thuốc thử vanilin/H2SO4. Với
thuốc thử FeCl3 khi để nguội khơng màu cịn khi hơ nóng có màu xanh đen.
Từ phân đoạn 82 đến phân đoạn 88 với hệ dung mơi n-hexan/EtOAc tỉ lệ thể tích 7/3, chấm trên bản mỏng cho 2 vệt rất gần nhau có Rf = 0,82 và 0,85. Cơ đuổi hết dung môi thu được dạng tinh thể lẫn dầu (bẩn). Tiếp tục tiến hành chạy cột tinh với phân đoạn này. Trộn cặn của phân đoạn 3 với 1 lượng silica gel vừa đủ, sấy dưới ánh sáng tử ngoại đến khô kiệt.
Cột tinh loại nhỏ = 1 cm, l = 40 cm được nhồi ướt với 14 gam silica gel hòa trong hexan. Cho chất lên cột và hệ dung môi chạy cột hexan: EtOAc là 9,5:0,5. Thử SKLM với hệ dung môi triển khai 9:1. Thuốc hiện màu là vanilin thu được 4 phân đoạn có sắc phổ giống nhau.
Phân đoạn 31 đến phân đoạn 40 (Rf = 0,65, màu tím xanh). Kí hiệu P7, 150 mg. Phân đoạn 44 đến phân đoạn 55 (Rf ≈ 0,45 màu vàng). Kí hiệu P8, 50 mg.
Phân đoạn 67 đến phân đoạn 87 (Rf = 0,25 màu vàng nhạt). Kí hiệu P9
Cơ đuổi dung môi các phân đoạn thu được tinh thể P7, P8; chất dầu là P6,P9. Kiểm tra lại SKLM, thuốc thử FeCl3 với tinh thể P7 cho màu xanh đen khi hơ nóng.
2.3.7.2. Phân lập các chất trong cặn chiết bằng n- hexan:
Làm tương tự như phần 2.3.7.1 đối với 2 g cặn H.
Rửa cột bằng hệ dung môi n-hexan /EtOAc tỉ lệ 9/1 theo thể tích với tốc độ 20 giọt /phút và lấy thành các phân đoạn, mỗi phân đoạn 6 ml. Kiểm tra các phân đoạn bằng SKLM và thu gom các phân đoạn chỉ cho một vệt giống hệt nhau, về Rf và màu sắc phổ với cả 2 thuốc thử vanilin/H2SO4 1% và FeCl3 1M (pH= 4).
Phân đoạn từ 103 đến phân đoạn 124 sau khi hứng dung môi từ cột, thử SKLM với thuốc thử vanilin/H2SO4 1% trên bản mỏng thấy xuất hiện các chấm tròn màu hồng giống nhau Rf = 0,5 trong hệ dung môi triển khai 9:1, tiến hành cất đuổi dung môi thu được chất dầu khơng màu. Kí hiệu là H6.
Kiểm tra SKLM với thuốc hiện FeCl3 1M khơng có màu ở nguội nhưng có màu xanh đen khi hơ nóng.