rắn. Đun trên bếp cách cát cho đến khi có khói trắng bốc lên. Tiếp tục cho axit vào và đun thêm nhiều giờ cho tới khi chất rắn chuyển hoàn toàn sang màu nâu đen. Để nguội hỗn hợp một chút rồi cho vào đó 5 ml dung dịch H2O2 30%, lại cho lên bếp và đun cho tới khi có khói trắng bốc ra. TiÕp tơc bỉ sung H2O2 và đun cho đến khi thu đ-ợc dung dịch trong suốt, có màu vàng. Pha loÃng bằng dung dịch HCl 0,5M, khi này palađi tồn t¹i ë d¹ng H2PdCl4.
Thêm vào dung dịch này l-ỵng d- NH4OH sau ®ã lại cho dung dịch HCl 0,5M vào ta sẽ thu đ-ợc kÕt tđa mµu vµng Pd(NH3)2Cl2 ch-a tinh khiÕt.
Lọc, rửa kết tủa sau đó hồ tan lại kết tủa vào dung dịch NH3, råi lại cho tiếp dung dịch HCl vo ta s thu đ-ợc kết tủa Pd(NH3)2Cl2 tinh khiÕt.
Nung kÕt tña ë 1000oC ta sẽ thu đ-ợc palađi kim loại.
2.6. THĂM DỊ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC PHỐI TỬ CÁC PHỨC CHẤT CHẤT
Phƣơng pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định:
2.6.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp pha loãng đa nồng độ. Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thơng qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (Minimum inhibitor concentration - nồng
Luận văn thạc sĩ khoa häc Nguyễn Thị Hạnh-K20
độ ức chế tối thiểu), IC50 (50% inhibitor concentration - nồng độ ức chế 50%), MBC (Minimum bactericidal concentration - nồng độ diệt khuẩn tối thiểu).
2.6.2. Các chủng vi sinh vật kiểm định
Bao gồm những vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở người:
- Bacillus subtilis: là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, thường không gây
bệnh.
- Staphylococcus aureus: cầu khuẩn gram (+), gây mủ các vết thương, vết
bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng.
- Lactobacillus fermentum: vi khuẩn gram (+), là loại vi khuẩn đường ruột lên men có ích, thường có mặt trong hệ tiêu hố của người và động vật.
- Escherichia coli: vi khuẩn gram (-), gây một số bệnh về đường tiêu hoá như viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm lỵ trực khuẩn.
- Pseudomonas aeruginosa: vi khuẩn gram (-), trực khuẩn mủ xanh, gây
nhiễm trùng huyết, các nhiễm trùng ở da và niêm mạc, gây viêm đường tiết niệu, viêm màng não, màng trong tim, viêm ruột.
- Salmonella enterica: vi khuẩn gram (-), vi khuẩn gây bệnh thương hàn, nhiễm trùng đường ruột ở người và động vật.
- Candida albicans: là nấm men, thường gây bệnh tưa lưỡi ở trẻ em và các
bệnh phụ khoa.
2.6.3. Môi trường nuôi cấy
MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth); TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi khuẩn; SDB (Sabouraud-2% dextrose broth) và SA (Sabouraud-4% dextrose agar) cho nấm.
2.6.4. Cách tiến hành
a. Phương pháp pha loãng đa nồng độ
* Pha loãng mẫu thử
- Mẫu ban đầu được pha trong DMSO với nồng độ thích hợp theo yêu cầu và mục đích thử.
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Hạnh-K20
- Mẫu ban đầu có nồng độ 40mg/ml được pha lỗng thành các nồng độ khác nhau để thử hoạt tính với các chủng từ nồng độ 128g/ml; 32g/ml, 8g/ml; 2g/ml; 0.5g/ml.
* Thử hoạt tính
- Chuẩn bị dung dịch vi sinh vật hoặc nấm với nồng độ 5.105 cfu/ml khi tiến hành thử.
- Lấy 10 l dung dịch mẫu thử theo các nồng độ đã được pha loãng, thêm
200 l dung dịch vi sinh vật và nấm, ủ 37oC trong 24 giờ.
* Chất tham khảo
- Kháng sinh Ampixilin cho các chủng vi khuẩn gram (+) và chủng vi khuẩn Ec gram (-) với giá trị IC50 trong khoảng 0,05-2 g/ml.
- Hỗn hợp kháng sinh Pen/Step cho chủng vi khuẩn Pa gram (-) với giá trị IC50 trong khoảng 4-5 g/ml.
- Amphoterixin B cho nấm với giá trị IC50 trong khoảng 0,5-1 g/ml.
b. Xử lý kết quả
- Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật.
- Giá trị IC50 được tính tốn dựa trên số liệu đo độ đục của môi trường nuôi cấy bằng máy quang phổ TECAN (Genios) và phần mềm raw data.
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Hạnh-K20
Ch-ơng 3: kết quả và thảo luận
3.1. Kết quả phân tích hàm l-ợng kim loại trong phức chất Kết quả phân tích hàm l-ợng ion kim loại trong các phức chất và tính tốn theo cơng thức giả định đ-ợc chỉ ra trên b¶ng 3.1:
B¶ng 3.1: KÕt quả phân tích hàm l-ợng kim loại trong các phức chÊt
STT Phøc chÊt Hµm l-ợng ion kim loại
Lí thut (%) Thùc nghiƯm (%) 1 Ni(mthact)2 12,03 12,36 2 Pd(mthact)2 20,00 20,67 3 Ni(thact)2 12,78 12,90 4 Pd(thact)2 21,12 21,23 5 Ni(athact)2 10,86 11,02
Kết quả trên cho thấy hàm l-ợng kim loại xác định theo thực nghiệm và tính tốn lý thuyết khá phù hợp nhau. Điều đó khẳng định cơng thức giả định là hợp lý.
3.2. Nghiªn cøu cấu tạo của CáC phức chÊt b»ng c¸c ph-ơng pháp phổ.
3.2.1. Nghiên cứu phối tử Hthact và hai phøc chÊt Ni(thact)2 và Pd(thact)2 3.2.1.1. Ph hồng ngoại của Hthact, Ni(thact)2 và Pd(thact)2
CÊu t¹o cđa 2-acetyl thiophene và hai dạng tồn tại của Hthact: dạng thion và thiol nh- sau: S C O CH3 2-acetyl thiophene S C H3C N N H C S NH2 S C H3C N N C SH NH2 (1) (2) (4) (1) (2) (4) D¹ng thion D¹ng thiol
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Hạnh-K20
Phỉ hÊp thơ hång ngo¹i cđa Hthact vµ phøc chÊt cđa nã víi Ni(II) vµ Pd(II) đ-ợc chỉ ra trên hình 3.1, 3.2, 3.3 ; các dải hấp thụ chính đ-ợc liệt kê trong bảng 3.2
Hình 3.1: Ph hấp th hồng ngoại ca Hthact
Hình 3.2: Phỉ hÊp thơ hång ngo¹i cđa Ni(thact)2
Luận văn thạc sĩ khoa häc Ngun Thị Hạnh-K20
Bảng 3.2: Cỏc di hp th c tr-ng trong ph ca Hthact, Pd(thact)2 và Ni(thact)2
Hp chất
Dải hÊp thơ
(NH) (N(2)=C) (C=N(1)) (CNN) (C=S)
Hthact 3229,13 - 1583 1435 831
Ni(thact)2 3414,74 1585 1550 1444 706
Pd(thact)2 3316,48 1607 1529 1400 720
Trên phổ hấp thụ hồng ngoại của phối tử và cả hai phức chất đều xuất hiện các dải hấp thô ë vïng 3200 - 3400 cm1, đặc tr-ng cho dao động hố trị của các nhóm NH. Tuy nhiên, trong phổ của phức chất thì c-ờng độ các dải này đà bị giảm khá mạnh. Điều này có thể đ-ợc giải thích là khi tham gia tạo phức phi t tồn tại ở dạng thiol một nguyên t H cđa nhãm N(2)H đà bị tách ra và dải trong phổ của phức chất chỉ là dải hấp thụ của liên kÕt nhãm NH trong N(4)H2 chứ khơng phải l tớn hiu trùng chập ca cả nhóm N(1)H và N(4)H2 nh- trong phèi tư tù do.
Trªn phỉ hÊp thơ hồng ngoại của phối tử tự do Hthact cũng khơng thÊy xt hiƯn d¶i hÊp thụ đặc tr-ng cho dao động hoá trị của liên kÕt S – H ë vïng 2570 cm1 mµ thÊy xuất hiện dải hấp thụ đặc tr-ng cho dao động hoá trị của liên kết C = S, điều nµy cho thÊy phèi tư tù do tồn tại ở dạng thion trong điều kiện ghi phỉ. Trªn phỉ cđa phèi tử dải này xuất hiện ở vị trí 831 cm1 nh-ng khi tạo phức dải này lại xuất hiện ở vÞ trÝ 706 cm1 trong phøc cđa Ni(II) vµ 720 cm1 trong phøc cđa Pd(II). Sù chun dịch về phía số sóng thấp hơn này đ-ợc giải thích là do sự thiol hố của phần khung thiosemicacbazon vµ S sÏ tham gia liên kết với Ni(II) hoặc Pd(II). Một bằng chøng kh¸c cho thÊy nguyªn tư H ë N(2)H bị tách ra là sù xt hiƯn cđa d¶i hấp thụ đặc tr-ng cho dao động hoá trị của liên kết N = C trong hai phøc chÊt, ë 1585cm1 trong phøc chÊt cđa Ni(II) vµ ë 1607 cm1 trong phøc chÊt cđa Pd(II).
Ngồi ra, trên phổ của phối tử tù do cã d¶i hÊp thơ ë 1583 cm1 đặc tr-ng cho dao động hoá trị của liên kết C = N(1) nh-ng trong phổ của các phức chất thì dải này
bị giảm về c-ờng độ và dịch chuyển về số sóng thấp h¬n (ë 1550 cm-1 trong phøc
LuËn văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Hạnh-K20
N(1) có tham gia tạo liên kết phối trí với ion kim loại trung tâm. Vì khi tham gia liªn kÕt, mật độ electron trên nguyên tử này
giảm đi, kéo theo sự giảm về độ bội liên kết C = N và giảm số sóng của dải hấp thụ đặc tr-ng cđa nã.
Qua phân tích phổ hồng ngoại có thể thÊy khi t¹o phøc, phèi t Hthact đóng vai trò nh- phèi tư hai càng mang một điện tích
âm do tách bớt một proton và liên kết phối trí qua cặp nguyên tử cho là N(1) vµ S.
3.2.1.2. Phỉ céng h-ëng tõ 1H, 13C cđa Hthact vµ Ni(thact)2
3.2.1.2.1. Phổ 1H-NMR và 13C-NMR ca Hthact:
Đ có quy kÕt c¸c tÝn hiƯu céng h-ëng trong phỉ céng h-ëng tõ 1H-NMR vµ
13C-NMR cđa phèi tư vµ phức chất tr-ớc hết tiến hành phân tích phổ cộng h-ëng tõ
1H-NMR, 13C-NMR cđa thiosemicacbazit vµ 2-acetyl thiophene lµ hai chÊt đầu để tổng hỵp phèi tư Hthact. Phỉ céng h-ëng tõ 1H-NMR và 13C-NMR chn ca các cht đầu là thiosemicacbazit và 2-acetyl thiophene và các quy kết đ-ợc tham khảo từ th- viƯn phỉ chn cđa ViƯn Khoa häc - Công nghệ Nhật bản (AIST).
Phæ céng h-ëng tõ 1H, 13C chuẩn của thiosemicacbazit đ-ợc chỉ ra trên hình 3.4, 3.5 ; các tín hiệu đ-ợc liệt kê và quy kết trên bảng 3.3, 3.4.
H×nh 3.4: Phỉ 1H-NMR cđa thiosemicacbazit Bảng 3.3: Các tín hiệu trong phổ 1H-NMR cđa thiosemicacbazit STT VÞ trÝ (ppm) Đặc điểm tÝn hiƯu Quy kÕt 1 8,62 singlet NH 2 7,55 singlet NH2(2) 3 4,48 singlet NH2(1) N N C S NH2 C CH3 (1) (2) (4) S M M: Ni, Pd
Luận văn th¹c sÜ khoa häc Nguyễn Thị Hạnh-K20 H×nh 3.5: Phỉ 13C-NMR cđa thiosemicacbazit Bảng 3.4: Các tín hiệu trong phổ 13C-NMR cđa thiosemicacbazit STT VÞ trÝ (ppm) Quy kÕt 1 181,79 -C(1)=S-
Phỉ céng h-ëng tõ 1H, 13C chn cđa 2-acetyl thiophene đ-ợc chỉ ra trên hình 3.6, 3.7 ; các tín hiệu đ-ợc liệt kê và quy kết trên bảng 3.5, 3.6.
H×nh 3.6: Phỉ 1H-NMR cđa 2-acetyl thiophene
Bảng 3.5: Các tín hiệu trong phổ 1H-NMR cđa 2-acetyl thiophene
STT VÞ trÝ (ppm) Đặc điểm tín hiƯu Quy kÕt
1 7,693 duplet =CH(1) 2 7,630 duplet =CH(2) 3 7,125 duplet =CH(3) 4 2,560 singlet -CH3 H×nh 3.7: Phỉ 13C-NMR cđa 2-acetyl thiophene
Bảng 3.6: Các tín hiệu trong phỉ 13C-NMR cđa 2-acetyl thiophene STT VÞ trÝ (ppm) Quy kÕt 1 190,71 -C(1)=O- 2 144,52 =C(2)S 3 133,82 =C(3)H 4 132,61 =C(4)S 5 128,19 =C(5)H 6 26,83 -C(6)H3
Luận văn th¹c sÜ khoa häc Nguyễn Thị Hạnh-K20
Phæ céng h-ëng tõ 1H cña phèi tử Hthact đ-ợc chỉ ra trên hình 3.8 và các tín hiệu trong phổ đ-ợc liệt kê trong bảng 3.7.
H×nh 3.8: Phỉ 1H-NMR cđa phèi tư Hthact
Sù qui g¸n c¸c tÝn hiƯu céng h-ëng trªn phỉ 1H-NMR cđa phèi tư dựa trên vic so sánh ph cđa nã víi phỉ 1H-NMR cđa thiosemicacbazit vµ 2-acetyl thiophene đ-ợc chỉ ra ở bảng sau:
Bảng 3.7: Các tín hiệu trong phỉ 1H-NMR cđa phèi tư Hthact
STT VÞ trÝ (ppm) Đặc điểm tín hiệu TÝch ph©n Quy kÕt
1 10,35 singlet 1 N(2)H 2 8,31 singlet 2 N(4)H2 3 7,58 duplet 1 H (vßng thiophene) 4 7,52 duplet 1 H (vßng thiophene) 5 7,09 triplet 1 H (vßng thiophene) 6 2,33 singlet 3 CH3 (act)
Kh¸c víi phỉ cđa thiosemicacbazit, phỉ cđa Hthact kh«ng xt hiƯn tÝn hiƯu céng h-ëng ë vïng tr-êng cao cđa proton nhãm N(1)H2 ë vÞ trÝ 4,48 ppm. Điều này chứng tỏ phản ứng ng-ng tụ đà xảy ra ở vị trí N(1)H2 cđa thiosemicacbazit vµ nhãm
Luận văn thạc sĩ khoa häc Nguyễn Thị Hạnh-K20
C = O của 2-acetyl thiophene tạo thành phối tử thiosemicacbazon 2-acetyl thiophene (Hthact).
Ph¶n ứng ng-ng t chỉ xảy ra ở N(1) làm mất 2 proton cđa nhãm nµy nên phân tử thiosemicacbazon tạo thành vẫn giữ ngun hai nhóm N(2)H vµ N(4)H2 nh- trong
thiosemicacbazit. Trªn phỉ cđa Hthact tÝn hiƯu céng h-ëng cđa proton nhãm N(2)H
xt hiƯn ë 10,35 ppm víi tích phân bằng 1 và tín hiệu cộng h-ởng ở 8,31 ppm có tích phân bằng 2 là ca 2 proton nhãm N(4)H2.
C¸c tÝn hiƯu ë 7,58; 7,52; 7,09 ppm đều có tích phân bằng 1 đ-ợc qui gán cho các proton trong vịng thiophene. Tín hiệu cộng h-ởng ở vị trÝ 2,33 ppm cã tÝch ph©n bằng 3 đ-ợc qui gán cho 3 proton trong nhóm CH3 (act).
Đ qui gán c¸c tÝn hiƯu céng h-ëng cho các proton trong vòng thiophene chúng tôi đà tiến hành xây dựng mô phỏng phổ céng h-ëng tõ proton cña Hthact b»ng phÇn mỊm online ACD - Ilab [41] và trên hình 3.9 (b).
Trong phỉ m« phỏng các proton gắn với các nguyên tử cacbon C(1), C(2) vµ C(3) của vịng thiophene có tín hiệu cộng h-ởng t-ơng ứng ë 7,69; 7,49 vµ 7,17 ppm. T-ơng tự phổ mơ phỏng của Hthact, có thể qui gán các proton trong vòng thiophene cđa phỉ thùc nghiƯm nh- sau: Hai tÝn hiệu duplet ở vị trí 7,58; 7,52 ppm đều có tích phân là 1 đ-ợc gán cho tín hiƯu céng h-ëng cđa 2 proton ë vÞ trÝ (1) vµ (2) trong vịng thiophene. Tín hiệu triplet ở vị trí 7,09 ppm có tích phân là 1 đ-ợc qui gán cho proton ë vÞ trÝ (3) trong vßng thiophene.
Cã thĨ nhận thấy tín hiệu đặc tr-ng cho 3 proton của nhãm CH3 (act). Do c¸c proton trong nhóm này hồn tồn t-ơng đ-ơng nhau nên nã sÏ xuÊt hiÖn tÝn hiÖu cã đặc điểm là tín hiệu singlet, có tích phân là 3 và sẽ xuất hiện ở vùng tr-ờng cao. TÝn hiƯu singlet, s¾c nhän ë vïng tr-êng cao 2,33 ppm øng víi tÝch phân là 3 đ-ợc qui kÕt cho 3 proton trong nhãm CH3. Điều này khá phù hợp khi so sánh phổ của phối tử víi phỉ cđa 2-acetyl thiophene.
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Hạnh-K20
(a)
(b)
H×nh 3.9: Phỉ 1H-NMR cđa Hthact theo thực nghiệm (a) và mơ phỏng (b)
Bảng 3.8: Các tín hiu trong ph 1H-NMR ca phối tư Hthact theo thùc nghiệm và mô phỏng.
Proton Vßng thiophene
1 2 3 N(2)H N(4)H2 CH3 (act)
Phỉ thùc nghiƯm 7,58 7,52 7,09 10,35 8,31 2,33
Luận văn thạc sÜ khoa häc Ngun Thị Hạnh-K20
Các phân tích trên đây về phổ 1H-NMR cho phép khẳng định phối tử Hthact
đà đ-ợc tạo thành và tồn tại ở dạng thion trong điều kiện ghi phổ.
Phæ céng h-ëng tõ 13C của phối tử Hthact đ-ợc chỉ ra trên hình 3.10 và các tín hiệu trong phổ đ-ợc liệt kê trong bảng 3.10.
H×nh 3.10: Phỉ 13C-NMR cđa phèi tư Hthact
So s¸nh phỉ 13C-NMR cđa phèi tư víi phỉ 13C-NMR cña 2-acetyl thiophene
cã thĨ thÊy trong phỉ cđa phèi tử tự do biến mất tín hiệu cộng h-ởng đặc tr-ng cho nguyªn tư C nhóm C=O ở 190,71 ppm và xuất hiện thêm tín hiƯu céng h-ëng cđa nguyªn tử C nhóm C=N ở 144,81 ppm. Điều đó khẳng định thêm phản ứng ng-ng tụ
đà xảy ra giữa nhóm C=O cđa 2-acetyl thiophene vµ nhãm NH2 cđa
thiosemicacbazit. Và nh- vậy, tín hiệu ở vị trí 144,81 ppm với tích phân là 1 trong phổ của Hthact đ-ợc qui gán cho tÝn hiƯu céng h-ëng cđa nhãm C=N.
Tín hiệu singlet, sắc nét có độ dịch chun hãa häc ë vÞ trÝ 178,59 ppm víi
tích phân t-ơng ứng là 1 đ-ợc qui gán cho nhóm C=S. Trên phổ cộng h-ởng tõ 13C