1.3 .Các phƣơng pháp phân tích kháng sinh tetracycline
2.2. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Lấy mẫu, bảo quản mẫu
Mẫu đƣợc lấy theo qui định trong thông tƣ 14/2011/TT-BYT - Hƣớng dẫn chung về lấy mẫu thực phẩm phục vụ thanh tra, kiểm tra chất lƣợng, vệ sinh an toàn thực phẩm. Mẫu thịt và các sản phẩm thịt lấy theo TCVN 4833-1: 2002 [9] và mẫu thủy sản lấy theo TCVN 5276: 1990 [8]
2.2.2.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu
Mẫu phân tích đƣợc lấy về phịng thí nghiệm sau khi mã hóa, đƣợc chia thành 2 phần, một phần lƣu giữ trong tủ lạnh âm sâu (-200C) một phần để phân tích.
Tiền xử lý mẫu: Đối với các mẫu thủy sản nhƣ tơm, cá, mực, hàu sữa… bóc hết vỏ, mai, ruột, vẩy, xƣơng chỉ lấy phần thịt ăn đƣợc, đối với mâu thịt chỉ lấy phần thịt nạc bỏ hết mỡ và bì. Sau đó đồng nhất tồn bộ lƣợng thịt thu đƣợc bằng máy đồng nhất mẫu và phân tích ngay, nếu khơng phải đƣợc bảo quản trong bể lạnh (-200C).
-Chuẩn bị mẫu:
+Chuẩn bị mẫu phân tích: mẫu sau khi đƣợc đồng nhất cân những lƣợng bằng nhau (5 gam ) vào ống fancol 50 mL, thƣờng mỗi mẫu phân tích lặp lại 3 lần và kèm một mẫu thêm chuẩn.
+ Chuẩn bị mẫu trắng: là mẫu giống nhƣ mẫu phân tích nhƣng khơng có thành phần tetracycline.
Mẫu trắng thịt: lựa chọn thịt của công ty Lebio.
Mẫu trắng thủy sản: lựa chọn các sản phẩm thủy sản trong siêu thị Vinmex.Các mẫu trắng gửi song song tại 2 phịng thí nghiệm đã đạt ISO 17025 về chỉ tiêu phân tích nhóm tetracycline là trung tâm phân tích nơng sản vùng 1 và viện kiểm nghiệm quốc gia đều cho kết quả là không phát hiện. Mẫu trắng đƣợc xử lý giống nhƣ mẫu phân tích.
- Mẫu trắng thêm chuẩn: Cân trên cân phân tích vào 7 ống fancol một lƣợng (5 gam ) mẫu trắng vào mỗi ống, sau đó thêm 2 mL từng dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ (5,10,20,40,60,80,100 µg/L) vào lần lƣợt từng ống để xây dựng đƣờng chuẩn làm việc, sau đó lắc bằng máy lắc trịn 1 phút để chuẩn phân bố đều vào trong mẫu, sau đó để yên trong 30 phút để chuẩn có thời gian thẩm thấu vào trong mẫu.
- Mẫu thêm chuẩn: Bổ sung 2 mL dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ 20 µg/L vào mẫu phân tích.Tiến hành nhƣ chuẩn bị mẫu trắng thêm chuẩn.
-Xử lý mẫu:
+Chiết mẫu: Cân chính xác khoảng 5 g 0,100g mẫu đã đồng nhất ở trên vào ống
fancol 50 mL, thêm 20 ml dung dịch đệm McIlvaine – EDTA, lắc xoáy trong 1 phút. Lắc 10 phút trên máy lắc ngang sau đó siêu âm trong vịng 10 phút. Ly tâm lạnh (-150C) ở tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút. Gạn lấy dịch trong vào ống ly tâm thứ 2, phần bã đƣợc chiết tiếp với 10 ml dung dịch đệm McIlvaine – EDTA, lắc xoáy 1 phút, đem ly tâm lạnh ở tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút. Gộp dịch chiết vào ống fancol 50 mL thứ 2, thêm 1 ml acid trichloracetic 1.0 g/ml, lắc khoảng 30 giây.Ly tâm lạnh ở tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút.Lọc dịch chiết qua giấy lọc vào bình nón 100 ml. Dịch lọc đƣợc làm sạch qua cột SPE-C18.
Làm sạch và làm giầu mẫu:Trƣớc tiên cần hoạt hoá cột lần lƣợt bằng 3 ml MeOH loại tinh khiết phân tích, 3 ml nƣớc cất deion, 3mL đệm Mc llvaine EDTA, sau đó nạp mẫu qua cột, tốc độ chảy khơng quá 2 ml/phút. Khi toàn bộ lƣợng mẫu đã đƣợc nạp xong, loại bỏ tạp chất bằng 3 ml nƣớc cất.Hút khô 1 phút bằng máy hút chân khơng, sau đó ly tâm tách nƣớc ở tốc độ 5000 vịng/phút trong 5 phút. Cuối cùng rửa giải bằng 2 ml dung môi MeOH loại đặc biệt tinh khiết dùng cho MS/MS, tốc độ rửa giải không quá 2mL/phút, lọc qua màng 0,45 µm rồi bơm vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.
2.2.2.3. Phƣơng pháp phân tích -Các thơng số của hệ MS/MS -Các thông số của hệ MS/MS
Lựa chọn phƣơng pháp ion hóa điện hóa (ESI), các thơng số nhiệt độ buồng ion hóa, điện thế cho bộ phận kết nối giữa sắc kí lỏng và khối phổ đƣợc tối ƣu bằng chƣơng trình turning với chất chuẩn là reserpine, một số thông số khác nhƣ tốc độ khí dẫn mẫu, khí làm khơ, áp suất chân khơng, áp suất khí bắn phá.. đƣợc tối ƣu hóa và cài đặt sẵn trong phần mềm đƣợc đƣa ra trong bảng 2.1
Thông số Giá trị cài đặt
Khí Nebulzer(khí dẫn mẫu trong bộ ion
hóa) khí nito
Tốc độ 3.0 mL/phút
Khí Drying(khí làm khơ mẫu) khí nito Tốc độ 15 mL/phút Khí CID(khí hỗ trợ bắn phá ion) Áp suất 230 Pa Điện thế cho interface HV(Bộ phận kết
nối giữa sắc kí lỏng và khối phổ)
(+ 4,5 kV) và (-3,5 kV)
Ống mao quản vận chuyển ion (DL) Nhiệt độ 2500C Nhiệt độ buồng ion hóa (Heated Block) Nhiệt độ 4000C
Dwell time (số lần quét /giây) 100u/s
Độ phân giải Unit (thông thƣờng)
Hệ thống chân không :
Chân không sâu sử dụng bơm turbo
Chân khơng ngồi sử dụng bơm Rotary
Tốc độ hút đối với tứ cực thứ nhất Q1: 40L/s, Q2 bát cực là 260L/s, tứ cực thứ 2 Q3 là 210 l/s
Tốc độ hút là 28m3/giờ
Để chọn mảnh phổ phù hợp, cần thiết phải tối ƣu hóa thế phân mảnh ở Q2 viết tắt là CE và thế dẫn ion ở Q1 và Q3. Các bƣớc tối ƣu hóa đƣợc tiến hành nhƣ sau: Sử dụng dung dịch chuẩn hỗn hợp 3 kháng sinh TC,OTC,CTC nồng độ 1000 µg/L cho mỗi chất và cột rỗng ( steel oring SO 0.2 - Shimadzu).Trƣớc tiên vận hành thiết bị ở chế độ full scan (qt tồn dải), chế độ ion dƣơng để tìm các mảnh ion mẹ gồm mảnh (m/z= 445) của tetracycline, mảnh (m/z = 461) của oxytetracycline và mảnh (m/z = 479) của chlotetracycline. Tiếp tục tìm các mảnh ion con, chọn chế độ
Product ion scan (quét các mảnh ion con) lựa chọn thế bắn phá của CE từ thấp khoảng 10eV đến cao, cho đến khi còn khoảng 10% ion mẹ, lựa chọn CE đó để tiếp tục chƣơng trìnhAuto MRM(Multiple Reaction Monitoring ) tự động lực chọn các phản ứng,kết quả là thu đƣợc Q1, CE, Q3 tối ƣu cho từng mảnh ion con của từng chất phân tích (thƣờng có 3 mảnh ion con đặc trƣng ).
Cần khảo sát chƣơng trình gradient tỉ lệ các dung mơi giữa 2 kênh A và B để quá trình tách là tốt nhất, thơng số khác đặt theo bảng 2.2
Bảng 2.2 Các điều kiện phân tích cho hệ thống sắc kí lỏng
Thơng số Giá trị
Pha động Kênh B acetonitrile chứa 0,1 % acid
formic
Kênh A nƣớc cất deion chứa 0,1 % acid formic
Nhiệt độ buồng cột 400C
Áp suất bơm tối đa 300 psi
Tốc độ dịng 0,3 mL/phút
Thể tích bơm mẫu 10µL
Cột phân tích Inertsustain C18, hãng GL scientific – Nhật bản, kích thƣớc hạt 3µm, đƣờng kính cột 2,1mm, chiều dài: 150 mm.
Sử dụng dung dịch chuẩn có nồng độ 20 ppb để khảo sát chƣơng trình gradient. Trƣớc tiên đặt tỉ lệ thể tích ban đầu giữa kênh nƣớc và dung mơi là 90:10, sau đó tăng dần tỉ lệ dung môi 5%/1 phút. Kết thúc lần phân tích đầu tiên, xác định khoảng thời gian lƣu của 3 chất TC, OTC, CTC tƣơng ứng với tỉ lệ dung mơi, từ đó thay đổi chƣơng trình gradient, tuy nhiên khơng thiết lập chƣơng trình q nhiều bƣớc thay đổi nhằm thiết lập nhanh sự ổn định của áp suất cột, đến khi các chất tách ra hồn tồn, peak của chất nhọn, cân đối.
-Tính tốn kết quả
Từ kết quả tính trên đƣờng chuẩn, xác định nồng độ tetracycline trên mẫu nhƣ sau:
Cm = (C0 x V0) x R /m (µg/kg) Kí hiệu:
C0: là nồng độ mẫu xác định trên đƣờng chuẩn (µg/L) m: Khối lƣợng mẫu cân ban đầu (gam)
Cm: nồng độ tetracycline trong mẫu ban đầu (µg/kg)
V0: là thể tích dung dịch dùng để rửa giải chất phân tích (thƣờng V0 = 2mL) R: Hệ số thu hồi
Cơng thức tính R:
Từ cách thêm chuẩn trên mẫu (lựa chọn 20µg/L khi xác định trên đƣờng chuẩn)
R = (C0 thêm - C0) X100/20 (%)
C0thêm: là nồng độ mẫu thêm chuẩn xác định trên đƣờng chuẩn (µg/L) 2.2.2.4. Xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp phân tích
-Xác định giới hạn phát hiện của thiết bị (IDL): phân tích dung dịch chuẩn nồng độ 2 ppb đối với mỗi chất, tính tỉ lệ signal/noise (S/N), nếu S/N <3 cần tăng nồng độ khảo sát, nếu S/N > 3 giảm nồng độ khảo sát cho đến khi S/N xấp xỉ 3, chọn nồng độ đó là giới hạn phát hiện của thiết bị.
-Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp (MDL): Thêm chất chuẩn vào mẫu thịt trắng từ nồng độ bằng nồng độ giới hạn phát hiện của thiết bị, thực hiện q trình phân tích và tăng dần nồng độ cho đến khi tỉ lệ giữa tín hiệu phân tích trên nhiễu nền (signal/noise) xấp xỉ3, chọn nồng độ đó là giới hạn phát hiện của phƣơng pháp. -Giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp (MQL): lựa chọn MQL = 3x MDL. Sau đó kiểm tra tính đúng đắn của MQL bằng cách thêm chuẩn trên mẫu thịt trắng ở nồng độ MQL tính tốn độ lặp lại và thu hồi phù hợp với các yêu cầu của phụ lục F (AOAC).
-Khoảng tuyến tính, đƣờng chuẩn: Xây dựng đƣờng chuẩn trên nền mẫu trắng (7 điểm chuẩn) bắt đầu từ MQL. Tính tốn hệ số tƣơng quan hồi qui sao cho R> 0,995. Độ chệch của các điểm trên đƣờng chuẩn sau khi xây dựng đƣờng chuẩn phải nhỏ hơn 15% và riêng ở nồng độ MQL phải nhỏ hơn 20%
-Độ lặp lại: Phân tích mẫu thêm chuẩn lặp lại 12 lần ở 3 khoảng nồng độ MQL, giữa đƣờng chuẩn và cuối đƣờng chuẩn, tính CV và so sánh với bảng F tiêu chuẩn AOAC.
-Độ thu hồi: Phân tích mẫu thêm chuẩn lặp lại 12 lần ở 3 khoảng nồng độ MQL, giữa đƣờng chuẩn và cuối đƣờng chuẩn, tính độ thu hồi R(%) và so sánh với bảng F tiêu chuẩn AOAC.
-Độ đặc hiệu, chọn lọc của phƣơng pháp: Sử dụng phƣơng pháp thêm chuẩn sau chuẩn bị mẫu.Sau khi chuẩn bị mẫu trắng và phân tích trên thiết bị sắc kí, ta thêm chất chuẩn nồng độ 10 ppb vào mẫu đã chiết và phân tích mẫu này. So sánh sắc kí đồ của hai mẫu để đánh giá tính đặc hiệu, chọn lọc
-Độ ổn định của phƣơng pháp phụ thuộc nhiều vào tuổi thọ của cột phân tích. Ta so sánh 2 thông số để nhận định về độ ổn định là áp suất bơm và diện tích peak của chuẩn sau một thời gian sử dụng cột.
-Độ không đảm bảo đo: Phƣơng pháp tiếp cận để tính tốn độ khơng đảm bảo đo dựa vào kết quả xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp theo hƣớng dẫn của Eurachem, AGL18 [17] độ không đảm bảo đo bao gồm: độ chụm tổng hợp, độ đúng và độ tinh khiết của chất chuẩn
Cơng thức chung để tính độ khơng đảm bảo đo tổng hợp là: U= 2
Trong đó:
uc: Độ không đảm bảo đo của độ tinh khiết của chất chuẩn
ur: Độ không đảm bảo đo của độ đúng từ mẫu chuẩn (CRM) hoặc mẫu thêm chuẩn us: Độ không đảm bảo đo giữa các lần lặp lại
Cách tính các us độ khơng đảm bảo đo chuẩn nhƣ sau: uc= (100 - độ tinh khiết của chuẩn)/2 đơn vị (%) hoặc (ppb)
ur sử dụng mẫu chuẩn CRM:
Tính tốn độ thu hồi theo cơng thức:
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.Tối ƣu hóa các điều kiện phân tích các tetracycline trên hệ thống sắc kí lỏng khối phổ LC/MS-MS
3.1.1.Nghiên cứu tối ƣu hóa các thơng số của detector MS/MS
Tiến hành thay đổi giá trị điện áp đặt Q2 từ 5 – 50 V tăng dần 5V/1 lần quét. Trong dải đó lựa chọn một giá trị CE, cho kết quả peak ion nhọn và cân đối, tín hiệu tốt nhất. Tiếp tục khảo sát xung quanh giá trị CE thu đƣợc tăng /giảm 1V/1 lần quét 4 lần tăng và 4 lần giảm đồng thời kết hợp quét điện thế Q1 và Q3 từ 5 – 50 V, 1V/1 lần quét . Chọn giá trị CE, Q1, Q3 cho kết quả tín hiệu tốt nhất là giá trị tối ƣu.
Kết quả tối ƣu hóa cho hệ MS/MS gồm năng lƣợng bắn phá của bát cực Q2 kí hiệu (CE) và năng lƣợng cho tức cực Q1 và Q3 thể hiện qua bảng 3.1.
Bảng 3.1 Kết quả tối ƣu hóa của MS/MS
Chất phân tích Ion mẹ Ion con CE (V) Q1(V) Q3(V) m/z Oxytetracyclin 461 426 -20 16 18 461 443 -14 16 17 Tetracyclin 445 410 -19 16 19 445 427 -16 16 18 Clotetracyclin 479 444 -29 17 17 479 462 -11 17 19
Dựa vào kết quả tối ƣu hóa nhận thấy, cơ chế phân mảnh của cả 3 chất giống nhau: đều tạo ra 2 mảnh con bằng cách mất đi mảnh khối có m/z =35 và m/z =18 phù hợp với hầu hết các kết quả nghiên cứu của các bài báo đã đƣợc công bố. Theo tài liệu [72] 2 mảnh phổ đƣợc tách ra là: [M+H -H2O - NH3] và [M+H - H2O]. Cơ chế phân mảnh thể hiện trong bảng 3.2.
Bảng 3.2 Cơ chế phân mảnh cho tetracycline, oxytetracycline và chlotetracycline
Product ion (các sản phẩm ion) m/z
Tetracycline (MW = 444, [M + H]+ = 445) [M+H - H2O]. 427 [M+H -H2O - NH3] 410 Oxytetracycline (MW = 460, [M + H]+ = 461) [M+H - H2O]. 443 [M+H -H2O - NH3] 426 Chlorotetracycline (MW = 478, [M + H]+ = 479) [M+H - H2O]. 461 [M+H -H2O - NH3] 444
Theo kết quả phổ khối của cả 3 chất khảo sát bằng các chất chuẩn hỗn hợp nồng độ 20 ppb cho mỗi chất (Hình 3.1; Hình 3.2) nhận thấy, cƣờng độ mảnh phổ cao hơn ở mảnh [M+H -H2O - NH3], do vậy lựa chọn mảnh [M+H -H2O - NH3] làm ion định lƣợng và mảnh [M+H - H2O]làm ion định danh.
Hình 3.1 Phổ khối của tetracycline, oxytetracycline và chlortetracycline ở nồng độ 20 ppb
Hình 3.2Mảnh phổ của tetracycline, oxytetracycline và chlortetracycline ở nồng độ 20 ppb
3.1.2. Tối ƣu hóa các điều kiện của sắc kí lỏng
Tiến hành thí nghiệm khảo sát chất chuẩn hỗn hợp 20 µg/L của 3 chất phân tích (TC,OTC, CTC), chƣơng trình gradient dung môi (2 kênh) đƣợc đƣa ra trong bảng 3.3, với thành phần hai kênh nhƣ sau:
Kênh A: Nƣớc cất deion và 0,1% axit formic Kênh B: acetonnitril và 0,1% axit formic
Bảng 3.3 Chương trình Gradient dung môi đã tối ưu
Thời gian (phút) Kênh A (%v/V) Kênh B (%v/V)
0 90 10 0.5 90 10 3.5 20 80 6.5 20 80 10 90 10 13 90 10
Khi tăng nồng độ kênh dung mơi hữu cơ (kênh B) chất phân tích ra khỏi cột nhanh hơn. Theo chƣơng trình gradient đã đƣợc tối ƣu, oxytetracycline ra khỏi cột đầu tiên với thời gian lƣu 4,60 phút, tiếp theo là tetracycline là 4,77 phút và chlotetracycline là 5,06 phút. Nhận thấy cả 3 chất đều kém phân cực do vậy có ái lực rất tốt với cột C18, pha động là acetonitrile và nƣớc bổ sung acid formic có khả năng hịa tan tốt nhóm tetracycline. Ban đầu dung môi chủ yếu là nƣớc (90%) để nhóm tetracycline tƣơng tác với cột đồng thời ổn định vị trí phân bố trên cột, khi đã phân bố ổn định rồi, để q trình tách sắc kí xảy ra, tăng lƣợng dung môi lên một cách từ từ (10 – 80% trong 3 phút) sau đó duy trì dung mơi ở 80% đẩy nhanh chất ra khỏi cột đồng thời làm sạch cột, cuối cùng duy trì tỉ lệ pha động bằng với nồng độ ban đầu để ổn định cột cho lần bơm tiếp theo, đảm bảo các lần bơm cột đều ổn định nhƣ nhau.
Trong 3 kháng sinh, tetracycline và oxytetracycline có ái lực gần nhƣ giống nhau đối với pha tĩnh và pha động, do vậy thời gian lƣu rất gần nhau, riêng đối với
gian lƣu sẽ dài hơn và dễ dàng tách ra khỏi 2 chất cịn lại. Phổ đồ của chƣơng trình gradient chƣa tối ƣu thể hiện qua hình Hình 3.3 và phổ đồ của chƣơng trình gradient đã tối ƣu thể hiện qua Hình 3.4
Hình 3.3 Phổ khối của chƣơng trình gradient chƣa tối ƣu
Chƣơng trình gradient chƣa tối ƣu: Trong khoảng 0- 5 phút, kênh B là 50%, từ 5 – 10 phút, kênh B 70%, từ 10-15 phút kênh B 50%.
Khi chƣa tối ƣu gradient các kênh dung môi, TC và CTC chƣa tách đƣợc hoàn toàn các chất đồng phân và nền mẫu, do vậy peak của 2 chất này bị dính chân khơng xác định đƣợc
3.2 Nghiên cứu tối ƣu hóa q trình xử lý mẫu 3.2.1 Chiết tách chất phân tích ra khỏi nền mẫu: 3.2.1 Chiết tách chất phân tích ra khỏi nền mẫu: 3.2.1.1 Lựa chọn dung mơi chiết chất phân tích
Nhóm TCs tan tốt trong mơi trƣờng axit lỗng và rất nhiều dung mơi hữu cơ nhƣ methanol, ethanol, acetonitril, ethyl acetate, không bền trong môi trƣờng kiềm. Do vậy chúng tôi tiến hành chiết mẫu trắng (mẫu thịt) thêm chuẩn hỗn hợp 10 µg/kg và chất chuẩn hỗn hợp nồng độ 10µg/L bằng đệm McILvaine EDTA pH
4±0,05 và song song chiết bằng acetonitrile + 0,1M axit phosphoric, thực hiện đúng