Hình 18. Phổ 13C-NMR của hợp chất SN2
Hình 20. Phổ HSQC của hợp chất SN2
4.1.3. Hợp chất SN3: Khasianine
Hình 22. Cấu trúc hóa học và các tƣơng tác HMBC chính của hợp chất SN3
Hợp chất SN3 phân lập được dưới dạng bột vơ định hình màu trắng. Công thức phân tử của hợp chất SN3 cũng được xác định là C39H63O11N dựa trên phân tích phổ
khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS với sự xuất hiện của peak ion giả phân tử tại
m/z 722,4474 [M+H]+ (tính tốn cho cơng thức C39H64O11N, 722,4479). Phân tích phổ
1
H-NMR và HSQC của SN3 nhận thấy xuất hiện các tín hiệu bao gồm: tín hiệu của hai proton anome [δH 4.69 (br s) và 4.27 (d, J = 7.5 Hz)], một proton olefin [δH 5.33
(br d, J = 4.5 Hz)], ba nhóm methyl bậc 2 [δH 1.09 (d, J = 6.0 Hz), 0.86 (d, J = 7.0
Hz), và 0.77 (d, J = 6.5 Hz)], hai nhóm methyl bậc 3 [δH 0.97 (s) và 0.75 (s)]. Phổ 13C- NMR và DEPT của SN3 cho biết sự có mặt của 39 carbon bao gồm bốn carbon không liên kết với hydro, 19 nhóm methine, 11 nhóm methylene, và năm nhóm methyl. Sự tương đồng về các tín hiệu phổ 1H-và 13C-NMR của SN3 so với SN1 và SN2 cũng gợi ý SN3 là một steroidal alkaloid glycoside có phần aglycone giống với SN1 và SN2.
Tuy nhiên, sự xuất hiện tín hiệu của hai cặp carbon/proton anome (δC/δH 100.65/4.27, và 100.46/4.69) đã chỉ ra SN3 có chứa 2 đơn vị đường. Ngồi sự có mặt của một đơn vị đường rhamnose giống như SN2, các giá trị độ chuyển dịch hóa học của carbon
thuộc đơn vị đường còn lại gồm C-1′ (δC 100.65), C-2′ (δC 73.70), C-3′ (δC 75.35), C- 4′ (δC 76.65), C-5′ (δC 75.16), C-6′ (δC 60.12) cũng gợi ý cho thấy đơn vị đường còn lại là glucose. Các liên kết glycoside giữa Glc C-1′ và aglycone C-3, giữa Rha C-1″ và Glc C-4′ cũng được xác định bởi các tương tác HMBC tương ứng gồm tương tác từ Glc H-1′ (δH 4.27) tới C-3 (δC 77.05), từ Rha H-1″ (δH 4.69) tới Glc C-4′ (δC 76.65). Quy kết các giá trị phổ 1H- và 13C-NMR của SN3 cũng được thực hiện dựa trên phân tích phổ 2 chiều HSQC và HMBC. Các số liệu phổ của SN3 nhận được cũng phù hợp với các số liệu phổ đã công bố của hợp chất khasianine, một steroidal alkaloid được phân lập từ loài S. khasianum [32]. Như vậy, cấu trúc hóa học của SN3 được xác định
Bảng 6. Số liệu phổ NMR của hợp chất SN3 và hợp chất tham khảo Pos. #δC δCa δHa (mult., J in Hz) 1 37.4 36.8 1.79 (m)/0.98 (m) 2 30.2 29.2 1.80 (m)/1.48 (m) 3 78.3 77.1 3.44 (m) 4 39.3 38.3 2.37 (m)/2.13 (dd, 11.5, 11.5) 5 140.7 140.4 - 6 121.7 121.1 5.33 (br d, 4.5) 7 32.3 31.7 1.87 (m)/1.15 (m) 8 32.5 31.0 1.57 (m) 9 50.3 49.7 0.90 (m) 10 37.0 36.4 - 11 21.2 20.4 1.48 (m)/1.40 (m) 12 40.1 39.4 1.70 (m)/1.11 (m) 13 40.6 39.8 - 14 56.7 55.9 1.03 (m) 15 31.6 31.6 1.95 (m)/1.51 (m) 16 78.7 77.7 4.18 (m) 17 63.5 62.3 1.69 (m) 18 16.5 16.1 0.75 (s) 19 19.4 19.1 0.97 (s) 20 41.6 40.8 1.75 (m) 21 15.6 15.2 0.86 (d, 7.0) 22 98.3 97.4 - 23 34.6 33.7 1.52 (m)/1.41 (m) 24 31.1 30.3 1.50 (m)/1.25 (m) 25 31.6 30.6 1.42 (m) 26 48.0 47.1 2.51 (m)/2.37 (m) 27 19.7 19.5 0.77 (d, 6.5) 3-O-Glc 1′ 102.7 100.7 4.27 (d, 7.5) 2′ 75.5 73.7 2.95 (m) 3′ 77.0 75.4 3.16 (m) 4′ 78.3 76.7 3.33 (m) 5′ 76.6 75.2 3.23 (m) 6′ 61.6 60.1 3.58 (m)/3.43 (m) 4′-O-Rha 1‴ 102.4 100.5 4.69 (br s) 2‴ 72.5 70.7 3.60 (br s) 3‴ 72.8 70.6 3.40 (m)
4‴ 73.9 71.9 3.18 (m)
5‴ 70.3 68.6 3.84 (m)
6‴ 18.5 17.7 1.09 (d, 6.0)
a)đo trong DMSO-d6, #δC số liệu của khasianine [32]đo trong pyridine-d5
Hình 23. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất SN2
Hình 25. Phổ 13C-NMR của hợp chất SN3
Hình 272. Phổ HSQC của hợp chất SN3
4.1.4. Hợp chất SN4: Solanigroside Q (hợp chất mới)
Hình 29. Cấu trúc hóa học của SN4 và hợp chất tham khảo SN4a
Hợp chất SN4 phân lập được dưới dạng bột vơ định hình màu vàng nhạt. Cơng thức phân tử của SN4 được xác định là C45H73O18N dựa trên phân tích phổ khối lượng phân giải cao (m/z 916.4913 [M+H]+, tính tốn lý thuyết cho công thức phân tử C45H74O18N: 916.4906) và sự phù hợp của phổ 13C-NMR. Phân tích phổ 1H-NMR và HSQC của SN4 nhận thấy xuất hiện các tín hiệu bao gồm: tín hiệu của ba proton
anome [δH 5.23 (br s), 4.51 (d, J = 7.5 Hz), và 4.50 (d, J = 7.5 Hz)], một proton olefin 5.41 (br d, J = 4.5 Hz), hai nhóm methyl bậc 2 [δH 1.26 (d, J = 6.5 Hz) và 1.07 (d, J = 6.5 Hz)], hai nhóm methyl bậc 3 [δH 1.09 (s) và 0.82 (s)]. Phổ 13C-NMR và DEPT của
SN4 cho thấy tín hiệu của 45 carbon bao gồm bốn carbon khơng liên kết với hydro, 25
nhóm methine, 12 nhóm methylene, và bốn nhóm methyl. Các đặc trưng trên phổ 1H- và 13C-NMR của SN4 cũng cho thấy hợp chất này là một steroidal alkaloid glycoside. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của SN4 khá tương đồng với hợp chất SN4a [32], ngoại trừ các số liệu phổ của hợp phần đường. Từ đó cho phép dự đốn hai hợp chất này có khung aglycone giống nhau. Các tương tác HMBC từ H-19 (δH 1.09) tới carbon C-1 (δC 38.55)/C-5 (δC 141.96)/C-9 (δC 51.36)/C-10 (δC 38.11), cùng với giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-5 (δC 141.96, C), C-6 (δC 122.58, CH) cho phép xác định vị trí nhóm methyl tại C-10 và một liên kết đôi ở C-5/C-6 đặc trưng cho các steroidal alkaloid phân lập từ chi Solanum. Các tương tác HMBC giữa H-18 (δH 0.82) với
carbon C-12 (δC 80.28)/C-13 (δC 47.13)/C-14 (δC 56.34)/C-17 (δC 63.50) và giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-12 (δC 80.28) cho phép xác định nhóm methyl tại C-13 và sự có mặt của một nhóm hydroxy tại C-12. Hơn nữa, tín hiệu cộng hưởng của C-12 tại δC 80.28 cũng cho phép khẳng định cấu hình beta của nhóm hydroxyl tại C-12 (β-OH: C-12 δC 77.8~79.0 [16]; α-OH: C-12 δC 71.4~71.7 [13]). Tương tác HMBC giữa H-21 (δH 1.07) với carbon C-17 (δC 63.50)/C-20 (δC 43.50)/C-22 (δC 99.86) cho phép xác định vị trí của hai nhóm methyl tại C-20. Tương tự như các hợp chất SN1‒3, giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-23 tại δC 34.44 cũng khẳng định cấu hình „R‟ tại C-22. Đồng thời tín hiệu C-27 xuất hiện tại δC 66.52 và tương tác HMBC từ H-27 (δH 3.36/3.41) tới carbon C-24 (δC 25.46)/C-25 (δC 39.44)/C-26 (δC 43.92) cũng chỉ ra vị trí nhóm hydroxymethyl ở C-25.
Hình 30. Các tƣơng tác HMBC chính của hợp chất SN4
Hợp phần đường của SN4 được đề nghị tương tự với hợp phần đường của SN2
bởi sự tương đồng giữa các tín hiệu carbon tương ứng. Các liên kết glycoside từ Gal C-1′ tới aglycone C-3, từ Rham C-1″ tới Gal C-2′, và từ Glc C-1‴ tới Gal C-3′ được khẳng định bằng các tương tác HMBC của Gal H-1′ (δH 4.51) với aglycone C-3 (δC 78.85), của Rha H-1″ (δH 5.23) với Gal C-2′ (δC 75.63), và của Glc H-1‴ (δH 4.50) với Gal C-3′ (δC 85.62). Từ những minh chứng trên, cấu trúc hóa học của SN4 được xác
định là một steroidal alkaloid glycoside mới và được đặt tên là solanigroside Q.
Bảng 7. Số liệu phổ NMR của hợp chất SN4 và SN4a
Pos. #δC δC δH (mult., J in Hz) 1 37.5 38.6 1.88 (m)/1.12 (m) 2 30.1 30.7 1.95 (m)/1.62 (m) 3 76.8 78.9 3.65 (m) 4 38.9 39.2 2.49 (br d, 11.0)/2.32 (dd, 11.0, 11.0) 5 140.8 141.9 - 6 121.7 122.6 5.41 (br d, 4.5) 7 32.9 32.9 1.54 (m)/1.30 (m) 8 31.9 31.8 1.61 (m) 9 49.9 51.4 1.10 (m) 10 37.2 38.1 - 11 31.3 31.5 1.71 (m)/1.49 (m) 12 78.3 80.3 3.30 (m) 13 46.6 47.1 - 14 55.0 56.3 1.14 (m) 15 32.2 32.5 2.02 (m)/1.41 (m) 16 83.8 80.5 4.37 (m) 17 61.2 63.5 1.96 (m) 18 11.0 11.1 0.82 (s) 19 19.3 19.8 1.09 (s) 20 42.9 43.5 1.93 (m)
21 14.9 14.5 1.07 (d, 6.5) 22 99.4 99.9 - 23 30.9 34.4 1.70 (m)/1.63 (m) 24 23.6 25.5 1.68 (m)/1.47 (m) 25 36.7 39.4 1.73 (m) 26 43.5 43.9 2.86 (br d, 11.5)/2.62 (dd, 11.5, 11.5) 27 64.5 66.5 3.36 (m)/3.41 (m) 3-O-Glc 3-O-Gal 1′ 100.3 100.8 4.51 (d, 7.5) 2′ 78.5 75.6 3.80 (m) 3′ 77.6 85.6 3.78 (m) 4′ 78.1 70.2 4.12 (br d, 2.5) 5′ 77.8 75.1 3.30 (m) 6′ 62.2 62.5 3.75*/3.72* 2′-O- Rha 2′-O-Rha 1″ 101.5 102.2 5.23 (br s) 2″ 72.7 72.1 3.97 (br s) 3″ 72.5 72.3 3.68 (m) 4″ 73.7 73.9 3.41 (m) 5″ 69.3 69.7 4.17 (m) 6″ 18.4 17.9 1.26 (d, 6.5) 4′-O- Rha 3′-O-Glc 1‴ 102.5 105.7 4.50 (d, 7.5) 2‴ 72.8 75.9 3.55 (m) 3‴ 72.5 78.2 3.37 (m) 4‴ 73.8 71.2 3.35 (m) 5‴ 70.2 77.9 3.30 (m) 6‴ 18.5 62.4 3.86 (br d, 12.0)/3.69*
*)tín hiệu bị che khuất, #δC số liệu của SN4a [32] đo trong pyridine-d5
Hình 31. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất SN4
Hình 33. Phổ 13C-NMR của hợp chất SN4
Hình 35. Phổ HSQC của hợp chất SN4
4.2. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất đã phân lập
Các hợp chất phân lập từ cây S. nigrum L đã được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên 4 dòng tế bào ung thư: MDA-MB-321 (ung thư vú người), A549 (ung thư phổi người), Hep3B (ung thư gan người), PC3 (ung thư tuyến tiền liệt người).
Bảng 8. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất SN1, SN2, SN3, SN4
Mẫu (µM) N.độ
TB sống sót (CS%)
MDA-MB-321 A549 Hep3B PC3
SN1 30 32.80±2.83 17.86±0.25 26.88±2.36 12.25±2.37 100 20.13±2.04 10.26±0.30 16.61±1.33 10.76± 2.49 SN2 30 51.01±1.74 56.90±2.03 49.93±0.95 56.34±2.70 100 26.00±2.49 32.12±1.69 18.74±1.80 18.09±1.69 SN3 30 61.29±1.02 64.99±2.60 82.16±0.63 52.63±1.11 100 45.75±2.77 45.14±1.77 66.09±0.95 45.73±1.43 SN4 30 59.27±2.00 70.80±0.88 62.44±2.15 55.92±0.43 100 48.62±2.19 62.46±2.64 58.34±2.73 52.94±1.16 Camptothecin* 0.3 60.11±1.29 63.79±1.07 65.16±1.31 66.91±1.13 30 19.71±3.17 26.52±0.86 26.04±2.19 19.92±2.92
*Camptothecin: được sử dụng làm chất chuẩn
Ở nồng độ 30 và 100 µM, hợp chất SN3, SN4 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào thấp trên cả 4 dòng tế bào ung thư MDA-MB-321, A549, Hep3B, PC3.
Các hợp chất SN1, SN2 có biểu hiện hoạt tính (CS ≤ 50% ± σ) được chọn ra để xác định giá trị IC50.
Bảng 9. Giá trị IC50 các mẫu SN1, SN2 Tên mẫu Giá trị IC50 (µM) MDA-MB- 321 A549 Hep3B PC3 SN1 1.86 ± 0.45 2.24± 0.15 0.78± 0.11 5.13± 1.34 SN2 57.54±1.89 33.11±1.12 18.20±1.43 33.11±1.56 Camptothecin 1,22±0,10 0.52±0.15 2,26 ± 0.86 10,36±1,19
Kết quả cho thấy các hợp chất thể hiện hoạt tính gây độc tê bào ung thư ở các mức độ khác nhau.
Hợp chất SN1 có hoạt tính gây độc tế bào mạnh nhất tương đương với chất đối chứng dương Camptothecin với giá trị IC50 trong khoảng 0,78 † 5,13 µM.
Cịn với hợp chất SN2 có hoạt tính gây độc tế bào với giá trị IC50 trong khoảng 18,20 † 57,54 µM.
KẾT LUẬN
1. Kết hợp các phương pháp sắc ký và các phương pháp phổ hiện đại đã phân lập
và xác định cấu trúc của 4 hợp chất kí hiệu SN1, SN2, SN3, SN4 từ cây lu lu đực
S.nugrum L. Trong đó:
Một hợp chất mới: Solanigroside Q (SN4)
Ba hợp chất đã biết: Solamargine (SN1) Solasonine (SN2) Khasianine (SN3).
2. Đã tiến hành thử hoạt tính gây độc tế bào trên 4 dịng tế bào ung thư (MDA-
MB, A549, Hep3B, PC3) của 4 hợp chất phân lập được.
Kết quả cho thấy: Hai hợp chất SN1, SN2 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào tốt nhất trên các dịng tế bào ung thư. Trong đó hợp chất SN1 thể hiện hoạt tính khá mạnh với giá trị IC50 0,78 - 5,13 µM. Hợp chất SN2 có hoạt tính gây độc tế bào với giá trị IC50 trong khoảng 18,20 - 57,54 µM.
Hợp chất SN3 và SN4 có hoạt tính gây độc tế bào thấp.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chung, Đỗ Trung Đàm, Phạm Vắn
HIển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn(2003), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam – Tập 2, NXB Khoa Học Kỹ Thuật, trang 179 – 181.
2. Lu lu đực. http://suckhoedoisong.vn/y-hoc-co-truyen/lu-lu-duc-20110718103935
962.htm.
3. Lu Lu Đực. http://www.thuocvuonnha.com/c/tac-dung-chua-benh-cua-cay-lu-lu
/thuoc-vuon-nha
4. Vũ Văn Hợp (2006), Nghiên cứu phân loại họ Cà (Solanaceae Juss.) ở Việt Nam,
Luận án tiến sỹ sinh học, tr. 44-86
5. Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam - Tập 1, 2, NXB Trẻ. Tiếng Anh
6. Akiyama, T. Ueoka, R. van Soest, R. W, and Matsunaga, (2009). "Ceratodictyols,
1-glyceryl ethers from the red alga-sponge association Ceratodictyon spongiosum/Haliclona cymaeformis". Journal of Natural Products, 72, 1552-
1554.
7. Aknin, M. Viracaoundin, I. Faure, R. Gaydou (1998). "5α,8α-Epidioxycholest-6-en-
3-β-ol from three cone snails of the Indian ocean". Journal of the American Oil Chemists' Society, 75, 1679-1681.
8. Aoki, S. Setiawan, A. Yoshioka, Y. Higuchi, K. Fudetani, R. Chen, Z.-S.,
Sumizawa, T. Akiyama, S.-i, and Kobayashi, M, (1999). "Reversal of multidrug resistance in human carcinoma cell line by agosterols, marine spongean sterols".
Tetrahedron, 55, 13965-13972.
9. Aratake, S, Trianto, A., Hanif, N, de Voogd, N. J., and Tanaka, J, (2009). "A new
polyunsaturated brominated fatty acid from a Haliclona sponge". Mar Drugs, 7, 523-527.
10. A.W. Wanyonyi, S.C. Chhabra, G. Mkoji, U. Eilert, W.M. Njue (2002),
''Bioactive steroidal alkaloid glycosides from Solanum aculeastrump''.
Phytochemistry, 59, 79-84.
11. Bergmann, W. and Burke, D. C., (1955). "Contributions to the study of marine
products.. XXXIX. TThe nucleosides of sponges. IV. Spongothymidine and spongouridine". Journal of Organic Chemistry, 20, 1501-1507.
12. Boone, C. W., Kelloff, G. J., and Malone, W. E., (1990). "Identification of
candidate cancer chemopreventive agents and their evaluation in animal models and human clinical trials: a review". Cancer Research, 50, 2-9.
13. Cassady, J. M, Baird, W. M, and Chang, C. J, (1990). "Natural products as a
source of potential cancer chemotherapeutic and chemopreventive agents".
Journal of Natural Products, 53, 23-41.
14. E.A. Eltayeb, A.S. Al-Ansari, J.G. Roddick (1997), ''Changes in the steroidal
alkaloid solasodine during development of Solanum nigrum and Solanum incanum''. Phytochemistry, 46, 489-494.
15. Gusman, J, Malonne, H., and Atassi, G, (2001). "A reappraisal of the potential
chemopreventive and chemotherapeutic properties of resveratrol".
Carcinogenesis, 22, 1111-1117.
16. Hanahan, D. and Weinberg, R. A., (2000) The hallmarks of cancer. Cell, 100, 57-
70.
17. H.M. Lin, H.C. Tseng, C.J. Wang, C.C. Chyau, K.K. Liao, P.L. Peng, F.P. Chou
(2007), ''Induction of autophagy and apoptosis by the extract of Solanum nigrum Linn in HepG2 cells''. J. Agric. Food Chem, 55, 3620-3628.
18. H.M. Lin, H.C. Tseng, C.J. Wang, J.J. Lin, C.W. Lo, F.P. Chou, ''Hepatoprotective
effects of Solanum nigrum Linn extract against CCl(4)-induced oxidative damage in rats''. Chem. Biol. Interact, 171, 283-293 (2008).
19. K. Hu, H. Kobayashi, A. Dong, Y. Jing, S. Iwasaki, X. Yao (1999),
''Antineoplastic agents. III: Steroidal glycosides from Solanum nigrum''. Planta Med, 65, 35-38.
20. K.T. Lim (2005), ''Glycoprotein isolated from Solanum nigrum L. kills HT-29
cells through apoptosis''. J. Med. Food, 8, 215-226.
21. K. Yoshida, S. Yahara, R. Saijo, K. Murakami, T. Tomimatsu, T. Nohara (1987),
''Changes caused by included enzymes in the constituents of Solanum nigrum berries''. Chem. Pharm. Bull, 35, 1645-1648.
22. Limin Xiang, Yihai Wang, Xiaomin Yi, Xiangjiu He (2018). "Anti-inflammatory
steroidal glycosides from the berries of Solanum nigrum L". (European black nightshade)”, Phytochemistry,148, 87-96.
23. Mayer, A. M. S. and Gustafson, K. R., Marine pharmacology in 2003–2004:
"Anti-tumour and cytotoxic compounds". European Journal of Cancer, 42, 2241- 2270.
24. McHardy, L. M., Sinotte, R., Troussard, A., Sheldon, C., Church, J., Williams, D.
E., Andersen, R. J., Dedhar, S., Roberge, M., and Roskelley, C. D., (2004) The tumor invasion inhibitor dihydromotuporamine C activates RHO, remodels stress fibers and focal adhesions, and stimulates sodium-proton exchange. Cancer Research, 64, 1468-1474.
25. Mizuho Ohno, Kotaro Murakami, Mona El-Aasr, Jian-Rong Zhou, Kazumi
Yokomizo, Masateru Ono, Toshihiro Nohara (2012), “New spirostanol glycosides from Solanum nigrum and S. jasminoides”. J Nat Med, 66, 658–663.
26. M.R. Cooper A.W. Johnson (1984), "Poisonous Plants in Britain and other effects
on Animals and Man". Great Britain Ministry of Agriculture, Fisheries and Food.
Vol. 161. H.M.S.O.
27. M. Yoshikawa, S. Nakamura, K. Ozaki, A. Kumahara, T. Morikawa, H. Matsuda
(2007), ''Structures of steroidal alkaloid oligoglycosides, robeneosides A and B, and antidiabetogenic constituents from the Brazilian medicinal plant Solanum lycocarpum''. J. Nat. Prod, 70, 210-214.
28. Nagle, D. G., Zhou, Y.-D., Mora, F. D., A, K., Mohammed, and Kim, Y.-P.,
(2004) "Mechanism targeted discovery of antitumor marine natural products".
Current Medicinal Chemistry, 11, 1725 - 1756.
29. Potawale S.E, Sinha S.D, Shroff K.K, Dhalawat H.J,
Boraste S.S, Gandhi S.P, Tondare A.D (2008), "Solanum Nigrum Linn: A Phytopharmacological Review", Pharmacologyonline 3, 140-163.
30. Rowinsky, E. K. and Donehower, R. C., (1991). "The clinical pharmacology and
use of antimicrotubule agents in cancer chemotherapeutics". Pharmacology & Therapeutics, 52, 35-84.
31. S.B. Mahato, N.P. Sahu, A.N. Ganguly, R. Kasai, O. Tanaka (1980), ''Steroidal
alkaloids from Solanum khasianum: Application of 13C NMR spectroscopy to their structural elucidation''. Phytochemistry, 19, 2017-2020.
32. S. Nakamura, M. Hongo, S. Sugimoto, H. Matsuda, M. Yoshikawa (2008), ''Steroidal saponins and pseudoalkaloid oligoglycoside from Brazilian natural medicine, “fruta do lobo” (fruit of Solanum lycocarpum)''. Phytochemistry, 69, 1565-1572.
33. Steele, V. E., (2003) Current mechanistic approaches to the chemoprevention of
cancer. Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 36, 78-81.
34. T. Ikeda, H. Tsumagari, T. Nohara (2000), ''Steroidal oligoglycosides from
Solanum nigrum''. Chem. Pharm. Bul., 48, 1062-1064.
35. T.S. Mohamed Saleem, C. Madhusudhana Chetty, S. Ramkanth, M.