1.4 .CƠ CHẾ BỆNH SINH BỆNH BẠCH CẦU CẤP
1.4.4. Một số biến đổi gen thƣờng gặp trong bạch cầu cấp dòng lympho
Khi nghiên cứu về BCC dịng lympho, ngƣời ta nhận thấy, có rất nhiều các bất thƣờng về vật chất di truyền đƣợc ghi nhận. Các bất thƣờng này có giá trị cao trong việc đƣa ra tiên lƣợng cho bệnh nhân [87] [121].
Các biến đổi di truyền thƣờng gặp và tiên lƣợng trong BCC dòng lympho đƣợc trình bày trong bảng 1.3.
Bảng 1.3. Các biến đổi di truyền và tiên lượng trong BCC dòng lympho [118] [121] [130]
Tốt Trên lƣỡng bội : >50 NST Chuyển đoạn t(12;21)
Trung bình Trên lƣỡng bội từ 47-50 NST
46XX/XY (bộ NST bình thƣờng) Chuyển đoạn t(1;19)
Xấu Thiểu bội, mất NST
Chuyển đoạn t(9;22)
Chuyển đoạn t(11q23), t(4;11) Chuyển đoạn t(5;14)
Giá trị tiên lƣợng nói lên khả năng đáp ứng thuốc, điều trị của các bệnh nhân BCC dòng lympho [142]. Các bất thƣờng di truyền đƣợc ghi nhận trong khoảng từ 80 - 90% bệnh nhân mắc BCC dịng B- lympho, và vì có giá trị cao trong tiên lƣợng bệnh, nên tổ chức y tế thế giới WHO đã đƣa ra tiêu chuẩn sử dụng các bất thƣờng di truyền để phân loại bệnh BCC dòng B lympho [130] [147]. Tuy nhiên, các bất thƣờng di truyền chỉ đƣợc ghi nhận ở khoảng 50- 60% bệnh nhân BCC dịng T lympho và cũng khơng có giá trị cao trong tiên lƣợng bệnh, nên đối với việc phân loại BCC dịng T lympho, WHO khơng đề cao tiêu chuẩn các bất thƣờng về mặt di truyền [121] [129].
1.4.4.1. Các bất thường tế bào di truyền ở BCC dòng B Lympho
Khi nghiên cứu các bất thƣờng di truyền trong tủy xƣơng bệnh nhân BCC dòng B lympho, nhận thấy chủ yếu gặp các bất thƣờng sau:
- Trên lƣỡng bội có trên 50 NST: loại bất thƣờng về số lƣợng cấu trúc NST này gặp với tần suất từ 25 - 30% số ca bệnh BCC ở trẻ em, bất thƣờng số lƣợng NST dẫn đến tình trạng tăng lƣợng ADN của các tế bào non ác tính
dịng lympho trong tủy. Phần lớn trẻ em mắc BCC lympho có số NST trên 50 đều ở độ tuổi từ 2- 10 [75] [121]. Các nhóm NST thƣờng gặp thêm là NST 2, 3, 4, 10, 18, thƣờng có tiên lƣợng tốt. Tuy nhiên, nếu có trên 50 NST nhƣng có thêm các chuyển đoạn khác đi kèm, bệnh có thể có tiên lƣợng chỉ ở mức trung bình [77] [113].
- Trên lƣỡng bội từ 47-50 NST: tần xuất gặp xấp xỉ 15%, có kèm các bất thƣờng về cấu trúc- khoảng 1/3. Các nhóm thƣờng có thêm NST là 8, 13, 21. Khơng có nhiều khác biệt về đặc điểm lâm sàng, hình thái, và miễn dịch huyết học ở nhóm bệnh nhân này, so với nhóm có trên 50 NST, nhƣng về độ tuổi có thể lớn hơn, số lƣợng bạch cầu máu ngoại vi tăng cao hơn [90] [100] [103] [121].
- Bộ nhiễm sắc thể bình thƣờng 46XX hoặc 46XY: gặp ở khoảng 10% bệnh nhân trẻ em, và có khoảng 30% ở ngƣời trƣởng thành. Nhóm này có tiên lƣợng trung bình [58] [77] [121].
- Thiểu bội: số bệnh nhân có dƣới 46 NST chiếm từ 2-9% số lƣợng các bất thƣờng. Phần lớn bệnh nhân có 45 NST, thƣờng mất một NST 20 ở trẻ em. Khơng có biểu hiện lâm sàng, hình thái hay miễn dịch khác biệt [58] [75] [121].
- Các bất thƣờng cấu trúc (pseudodiploid- giả lƣỡng bội): xuất hiện trong khoảng 40% số bệnh nhân BCC trẻ em, và khoảng 55% ngƣời trƣởng thành. Hiệu quả điều trị có liên quan đến loại đột biến khác nhau [58] [121].
Bảng 1.4. Các đột biến cấu trúc thương gặp ở BN BCC dòng lympho [121]
Chuyển đoạn NST Bất thƣờng gen mức phân tử
t(9;22)(q34;q11) t(4;11)(q21;q23)
gen ABL-BCR gen MLL-AF4 gen E2A-PB
t(1;19)(q23;q22) t(12;21)(p13;q22) t(11;14)(q31;q11) t(5;14)(q31;q32) t(17;19)(q21-22;p13) gen TEL-AML1 gen TCRδ- RBTN2 IL-3/IgH E2A/HLF
+ Chuyển đoạn t(9;22)(q34;q11): gặp nhiều trong BCC dòng B
lympho, là chuyển đoạn gen ABL (Alberson) trên NST 9q34 và BCR (Breakpoint cluster region – vùng cụm điểm gãy) trên NST 22q11. Chuyển đoạn này thƣờng hay gặp ở bệnh nhân bệnh bạch cầu mạn tính. Tuy nhiên, phân tích bằng các kĩ thuật phân tử nhƣ khuyếch đại chuỗi polyme - PCR, lai miễn dịch huỳnh quang - FISH cho thấy, chuyển đoạn này gặp nhiều trong BCC trẻ nhi, và khoảng ½ ngƣời trƣởng thành BCC dịng lympho có tiền sử bạch cầu mạn có đứt vùng BCR. Trong bạch cầu mạn, phân tử chuyển đoạn có kích thƣớc 210kD, là sản phẩm của major breakpoint (điểm gãy chính). Trong BCC dịng lympho, sản phẩm có kích thƣớc 190kD, là sản phẩm của minor breakpoint (điểm gãy phụ) [38] [109] [121]. Đoạn 11 trên cánh dài NST số 22 bị đứt a, chuyển đến gắn vào cánh dài NST số 9, và đoạn 34 trên cách dài NST số 9 đứt ra, chuyển đến gắn trên cánh dài NST số 22 (hình 1.3).
Bệnh nhân BCC dịng lympho có chuyển đoạn này có một số đặc điểm liên quan đến hình thái của các tế bào non: kích thƣớc lớn, nhân to, thơ, ngun sinh chất có thể tìm thấy nhiều hạt.
Hình 1.3. Sơ đồ minh họa chuyển đoạn gen ABL/BCR.
Về lâm sàng, BCC dịng lympho có chuyển đoạn ABL/BCR ở ngƣời lớn tuổi có các đặc điểm: số lƣợng bạch cầu tăng, thâm nhiễm nội tạng và hệ thần kinh trung ƣơng [67] [79].
Tiên lƣợng bệnh nhóm có chuyển đoạn ABL/BCR trƣớc đây không cao. Tuy nhiên gần đây, với sự ra đời của các thế hệ thuốc điều trị mới nhƣ Imatinib, tác dụng trực tiếp lên các vị trí chuyển đoạn, nhóm bệnh nhân có chuyển đoạn ABL/BCR đƣợc đánh giá là một trong những nhóm đạt hiệu quả cao trong điều trị.
+ Đảo đoạn 11q23 tại điểm MLL, khơng có đặc điểm đặc trƣng về hình thái, về lâm sàng thƣờng có tăng cao số lƣợng bạch cầu và lách to. Đặc điểm về dấu ấn miễn dịch khá đặc trƣng: CD10 dƣơng tính- đây là dấu ấn dịng B sớm, có thể xuất hiện đồng thời với CD15, CD33, CD13. Nhóm bệnh nhân có đảo đoạn 11q23 cũng thƣờng có tiên lƣợng bệnh xấu [114].
+ Chuyển đoạn gen MLL/AF4 t(4;11)(q21;q23): các chuyển đoạn
số 4 [115] [121] [124]. Nghiên cứu phân tử về MLL, Pui CH (2008) đã nhận thấy gen MLL có thể có sự kết hợp giữa đầu N trên MLL và đầu C của 40 gen khác nhau tạo ra các tổ hợp gen mới [117]. Trong đó, tổ hợp gen MLL/AF4 tạo ra một sản phẩm là MLL protein, protein này thúc đẩy hoạt động phiên mã, dẫn đến tình trạng rối loạn biểu hiện của gen điều khiển HOX, gây tăng cao số lƣợng bạch cầu, số lƣợng non ác tính.
Hình 1.4. Hình ảnh minh họa chuyển đoạn gen MLL/AF4 [117]
Những bệnh nhân dƣơng tính với chuyển đoạn này thƣờng gặp ở trẻ dƣới 1 tuổi với tần xuất 50-70%, ở ngƣời trƣởng thành khoảng 5% [114].
Nhóm có chuyển đoạn MLL/AF4 thƣờng gặp ở bệnh nhân BCC dịng B lympho, và thƣờng có số lƣợng bạch cầu tăng, thâm nhiễm thần kinh trung ƣơng [115] [121] [142]. Tỷ lệ sống sót của nhóm này thấp [33] [44].
và gen PBX là một trong nhữ chuyển đoạn xuất hiện nhiều ở trẻ em. Chuyển đoạn này có thể là chuyển đoạn cân bằng t(1;19)(q23;p13) hoặc không cân bằng der (19) (q23;p13). Tuy vậy, kết quả của các chuyển đoạn này là sự hoạt động của gen kết thúc E2A trên NST 19p13 và gen PBX1trên NST 1q23 [89] [92] [105].
Hình 1.5. Hình ảnh minh họa chuyển đoạn gen E2A/PBX
Chuyển đoạn t(1;19)(q23;p13) khơng có nhiều khác biệt về hình thái của các tế bào non ác tính nhƣng về đặc điểm dấu ấn miễn dịch có nhiều sai khác, CD19, CD10 dƣơng tính, nhƣng CD20 thƣờng âm tính [121].
Chuyển đoạn t(1;19)(q23;p13) thƣờng có báo cáo về tiên lƣợng khơng tốt với điều trị bằng hóa chất [38] [94] [150].
+ Chuyển đoạn t(12;21)(p13;q22): là chuyển đoạn giữa gen TEL và
gen AML1 có tần xuất gặp nhiều ở trẻ em [49] [151] [153].
Chuyển đoạn này không dễ phát hiện khi phân tích karyotype, thƣờng đƣợc phát hiện bằng kĩ thuật PCR hoặc FISH. Chuyển đoạn này không gặp ở
các trƣờng hợp trên lƣỡng bội >50 NST, nhƣng có thể xuất hiện cùng các dạng bất thƣờng về số lƣợng NST khác [121].
Chuyển đoạn t(12;21)(p13;q22) là sự chuyển dịch của gen TEL trên NST 12p23 đến gen AML1 trên NST 21q22 [85] [86] [96].
Hình 1.6. Hình ảnh minh họa chuyển đoạn gen AML1/TEL
Về hình thái và miễn dịch tế bào non ác tính, bệnh nhân BCC dịng lympho có chuyển đoạn t(12;21)(p13;q22) khơng có nhiều khác biệt [121].
Chuyển đoạn này thƣờng có tiên lƣợng tốt, nguy cơ bội nhiễm thấp [96] [99] [121].
1.4.4.2. Các bất thường tế bào di truyền ở BCC dòng T lympho
Các loại bất thƣờng di truyền trong BCC dòng T lympho cũng tƣơng tự nhƣ dòng B lympho. Tuy nhiên, các bất thƣờng trong dịng T lympho, khơng có giá trị cao trong tiên lƣợng bệnh nhƣ dòng B lympho [121].
Các loại bất thƣờng di truyền thƣờng gặp ở BCC dòng T lympho:
- Chuyển đoạn t(11;14): chuyển đoạn này chiếm khoảng từ 40 - 50% số bệnh nhân BCC dòng T lympho, chuyển đoạn này ít gặp ở BCC dòng B
TEL
AMLI-TEL AMLI
lympho. Khoảng ½ số BN này có đứt điểm trên thụ thể tế bào T (T- cell Receptor) 14q11, ở vị trí gen TCRδ, bất thƣờng này thƣờng có tiên lƣợng xấu [69] [92].
- Chuyển đoạn t(10;14), gặp với tần xuất từ 2-5% ở bệnh nhân BCC dòng T lympho nhƣng cũng là chuyển đoạn hiếm gặp ở BCC dòng B lympho [63][90].
- Trên lƣỡng bội 50NST cũng có gặp trong BCC dịng T lympho, thƣờng có tiên lƣợng xấu [74].
Các bất thƣờng di truyền trong BCC T lympho khơng có giá trị trong tiên lƣợng, nhƣng một vài mối liên quan giữa đột biến gen và lâm sàng đã đƣợc ghi nhận. Các tứ bội thƣờng gặp ở trẻ nhỏ, lâm sàng xấu, tế bào non ác tính thƣờng có kích thƣớc lớn [69].
1.5. KĨ THUẬT PCR TRONG PHÁT HIỆN CÁC BIẾN ĐỔI GEN 1.5.1. Khái niệm
- PCR-là thử nghiệm nhân bản một đoạn ADN trong ống nghiệm dựa vào các chu kỳ nhiệt [29].
Thử nghiệm này đƣợc thực hiện trong ống nghiệm nhỏ (micro tube) chứa dung dịch phản ứng có thể tích từ 10-50µl với các thành phần chủ yếu là:
+ Enzyme polymerase chịu nhiệt, thƣờng đƣợc gọi là Taq polymerase, có hoạt tính tối đa ở 72oC và bền với nhiệt độ.
+ 4 loại deoxyribonucleotide (dNTP): Adenin (dATP), Thymine (dTTP), Guanin (dGTP), Cytosine (dCTP).
+ DNA chứa các đoạn DNA cần nhân bản trong phản ứng.
oligonucleotide có trình tự bổ sung một cách đặc hiệu với hai đầu đoạn DNA cần nhân bản.
+ Ion Mg++ trong muối MgCl2 ở nồng độ thích hợp.
+ Dung dịch đệm Tris- KCl để làm dung mơi thích hợp cho phản ứng. Khi hỗn hợp dung dịch này đƣợc cho vào máy biến đổi nhiệt (thermal cycler), dƣới tác dụng biến đổi của chu trình nhiệt độ, phản ứng nhân bản sẽ xảy ra [36] [63].
1.5.2. Các dạng kĩ thuật PCR đƣợc áp dụng trong nghiên cứu
Có hai dạng kĩ thuật PCR đƣợc áp dụng trong phát hiện các bất thƣờng gen trong bệnh BCC, tùy thuộc vào loại sản phẩm di truyền tách chiết ban đầu là mRNA hay DNA:
- RT-PCR (Reverse Transcription PCR): Sao chép ngƣợc, enzyme phiên mã ngƣợc hoạt động, từ sợi đơn ARN đƣợc để tổng hợp mạch kép bổ xung (tạo sợi đôi cADN). Dƣới tác dụng của nhiệt độ cao (94 độ C), enzyme phiên mã ngƣợc sẽ bị bất hoạt. Sau đó, q trình tổng hợp để tạo các bản sao đoạn sợi cADN có trình tự gen bất thƣờng đƣợc phát hiện bởi các cặp mồi, sẽ thực hiện liên tục.
Hình 1.7. Hình ảnh minh họa cho q trình sao mã ngược tạo sợi đơi cADN từ sợi đơn ARN và quá trình tổng hợp sợi ADN [29].
- Nested - PCR ( PCR lồng): Tổng hợp các bản sao cADN ngay từ sợi đôi gốc. Kĩ thuật này cho phép tăng độ nhậy của các cặp mồi phát hiện đột biến. Bao gồm hai chu trình lồng vào nhau:
+ Chu trình 1: dùng cặp mồi nhận biết đoạn oligonucleotit dài
+ Chu trình 2: dùng cặp mồi đặc trƣng đột biến để nhân lên đoạn ngắn hơn từ đoạn dài đã có [29] [103] [141].
1.6. HOẠT ĐỘNG CỦA HỆ PROTEIN TRONG BỆNH BẠCH CẦU CẤP DÕNG LYMPHO DÕNG LYMPHO
1.6.1. Tác động của hệ protein lên hoạt động tế bào
1.6.1.1. Khái niệm về hệ protein
Protein bản chất là một chuỗi acid amin, là sản phẩm đầu ra của gen
trong tế bào. Trình tự các acid amin đƣợc mã hóa bởi các bộ ba nucleotit trên gen, hay nói cách khác, protein là sản phẩm thể hiện hoạt động của gen [139].
1.6.1.2. Biểu hiện và chức năng của protein
Sự biểu hiện hoặc chức năng của các protein đƣợc điều hòa tại nhiều thời điểm, từ phiên mã đến dịch mã và cả sau dịch mã [139]. Sau dịch mã, đa phần các phân tử protein lại bị biến đổi hóa học bởi các tƣơng tác protein- protein, hay các phản ứng với nhóm carbohydrat, phosphate… chính những biến đổi này đóng vai trị chủ yếu trong kích hoạt chức năng của nhiều protein chứ khơng phải đƣợc mã hóa trực tiếp từ gen [82]. Kết quả là từ một gen ban đầu, ta có thể tìm thấy sự đa dạng về biểu hiện, cấu trúc và chức năng của rất nhiều loại protein khác nhau [81]. Một số nghiên cứu cho thấy, từ một gen có thể phát sinh tới sáu protein ở ngƣời [139].
lệch về trình tự gen [132]. 98% số bệnh cịn lại cần đƣợc làm sáng tỏ ở mức độ tƣơng tác giữa các protein [91]. Điều này chứng tỏ, nhiều cá thể có bộ gen hồn tồn bình thƣờng nhƣng vẫn mắc bệnh, nguyên nhân có thể là do sự sai lạc trong các cấu trúc và mối tƣơng tác, biểu hiện của các protein [35] [63].
Vì vậy, ngày nay nhiều nghiên cứu đang tập trung vào việc phát hiện các protein chỉ thị bệnh. Protein chỉ thị bệnh là một trong số các chỉ số sinh học (biomarker) đƣợc tạo ra một cách bất thƣờng tại một thời điểm nào đó của đời sống tế bào hoặc bệnh nhân, có tác dụng nhƣ một dấu hiệu báo trƣớc [143]. Sự bất thƣờng này đƣợc biểu hiện thông qua nhiều con đƣờng nhƣ lƣợng protein nhiều hơn bình thƣờng, hoặc protein xuất hiện khơng đúng thời điểm đã đƣợc mã hóa sẵn trong chu trình tế bào. Các protein này thƣờng là sản phẩm của quá trình ghép nối sai các mảnh phiên mã mARN hoặc các dạng biến đổi bất thƣờng sau quá trình dịch mã, vì vậy các bất thƣờng này khơng có ngun nhân là các bất thƣờng gen, không phát hiện đƣợc ở mức độ gen [34]. Nhiều protein chỉ thị bệnh đã đƣợc phát hiện, nhận dạng trong huyết thanh và đã đƣợc phát triển thành kit chẩn đoán bệnh nhƣ: Apolipoprotein AI (Zhang et al., 2004; Kozak et al., 2005) [97] [154].
Nghiên cứu về protein là nghiên cứu về các chức năng của gen, có thể trả lời đƣợc các câu hỏi [60] [98] [143]:
- Phần nào của gen đƣợc biểu hiện?
- Gen biểu hiện ở đâu, khi nào và có bao nhiêu sản phẩm đƣợc biểu hiện? - Các sản phẩm protein bị biến đổi nhƣ thế nào, chúng tƣơng tác với nhau nhƣ thế nào?
Dựa vào các kĩ thuật phân tích protein nhƣ điện di hai chiều nhuộm huỳnh quang (2D-DIGE), sắc kí lỏng khối phổ (LC-MS/MS)… ngƣời ta đã phát hiện ra rất nhiều protein bất thƣờng có liên quan đến bệnh bạch cầu cấp [60] [88]. Sự có mặt với số lƣợng lớn hoặc biểu hiện quá mức của các protein này trực tiếp tác động lên q trình truyền tải thơng tin thúc đẩy tế bào sinh sản không ngừng, gây rối loạn tạo máu [98] [156].
- Protein CREB (response element binding protein): Mã hóa cho nhân tố đáp ứng cAMP, điều khiển các gen chịu trách nhiệm cho các quá trình tăng số lƣợng, sinh trƣởng và biệt hóa tế bào [143]. CREB đƣợc phát hiện có biểu hiện thừa cả ở mức độ phiên mã mARN và protein trong tủy xƣơng ở hầu hết bệnh nhân BCC, là một nguyên nhân thúc đẩy sự tăng sinh liên tục của các tế bào non ác tính. Vì vậy, mức độ biểu hiện của protein CREB đƣợc xem nhƣ một chỉ thị theo dõi diễn biến bệnh BCC [56].
-PRAME (preferentially expressed antigen in melanoma), một loại
kháng nguyên đặc trƣng cho sự xuất hiện của các khối u ác tính, đƣợc nhận thấy có biểu hiện quá mức ở 52.9% bệnh nhi mắc bệnh BCC [111].
1.6.3. Tác động của các protein khác
1.6.3.1. Tác động của các protein bất thường
Mức độ biểu hiện bất thƣờng của các protein trong những trƣờng hợp