chất lƣợng rƣợu vang
Rượu vang mới chỉ xuất hiện ở nước ta cách đây hơn 100 năm nhưng nó đã nhanh chóng trở thành thứ đồ uống khơng thể thiếu. Tuy nhiên, mức tiêu thụ rượu vang bình qn tính theo đầu người hiện nay ở nước ta cịn thấp, chỉ là 3-5 lít/năm. Do gặp nhiều khó khăn về thiết bị và qui trình cơng nghệ lạc hậu nên chất lượng vang Việt nam chưa cao. Để đáp ứng nhu cầu của thị trường, chúng ta đã thay đối qui trình cơng nghệ, rút ngắn thời gian lên men và dịch siro quả trước khi lên men bị đem thanh trùng nhằm tiêu diệt vi sinh vật nhiễm tạp và cũng vơ tình tiêu diệt ln quần thể vi khuẩn L.oenos q giá có trong ngun liệu cịn sót lại sau q
trình xử lý. Chính vì vậy q trình lên men malolactic khơng được thực hiện, khiến cho vang có vị chua “cứng”, chất lượng không ổn định, nhanh đục và hay bị nhiễm tạp. Chúng ta khơng sản xuất được rượu vang có chất lượng giống như rượu ngoại và do vậy chịu nhiều thua thiệt về giá cả, giá thành rượu nội chỉ bằng 5-10% so với rượu ngoại tương ứng và gây tiêu tốn ngoại tệ cho việc nhập khuẩn rượu [7].
Sản xuất vang theo truyền thống thì lên men malolactic diễn ra tự phát trong suốt quá trình bảo quản vang non trong thời gian vài tháng hoặc nhiều năm. Vi khuẩn có nguồn gốc trên vỏ quả nho hoặc ở thùng gỗ. Tuy nhiên, trong công nghệ sản xuất vang hiện đại với quá trình chế biến sạch hơn và thời gian bảo quản cần giảm tối thiểu thì quá trình lên men như vậy q chậm chạp và khơng đủ độ tin cậy. Như vậy lên men malolactic tự nhiên có những ưu điểm là thuận lợi và rẻ tiền, nhưng nhược điểm cũng rất nhiều như là: khó khởi động, diễn ra rất chậm chạp và khó kiểm sốt được các chủng vi khuẩn tham gia vào quá trình dẫn đến việc tạo các sản phẩm phụ không mong muốn. Để khắc phục, hiện nay người ta thường áp dụng phương pháp chủ động đưa vi khuẩn L.oenos thuần chủng vào môi trường để thực hiện lên men malolactic. Việc cấy vi khuẩn có thể diễn ra trong q trình lên men rượu (đồng thời với nấm men) hoặc sau khi hồn thành q trình lên men rượu [3,18,38].
Để khắc phục hiện trạng thực tế này người ta đã sử dụng vi khuẩn thuần khiết để thực hiện quá trình lên men malolactic. Ưu điểm của các chủng vi khuẩn này là có khả năng thích nghi cao với mơi trường rượu vang non có độ cồn cao (15% v/v), pH thấp (3,0) và có khả năng lên men mạnh các loại đường, đặc biệt là lên men axít malic thành lactic và axít xitric thành axetic. Có nhiều phương pháp sử dụng vi khuẩn O.oeni thuần khiết để thực hiện quá trình lên men malolactic nhưng nhìn chung dựa vào hai phương pháp sau đây:
Lên men một giai đoạn (lên men hỗn hợp): Lên men một giai đoạn có nghĩa là người ta cấy nấm men và vi khuẩn đồng thời trong quá trình lên men rượu. Phương pháp này có những ưu điểm: vi khuẩn sẽ có điều kiện sinh trưởng tốt hơn trong mơi trường có nồng độ cồn thấp và khi hàm lượng cồn tăng dần trong quá trình lên men rượu thì vi khuẩn sẽ được thích nghi dần với môi trường chứa rượu, chứ không bị sốc như khi đột ngột gặp mơi trường có nồng độ cồn cao, hơn nữa khi đó mơi trường cịn đang rất giàu chất dinh dưỡng nên thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Nuôi cấy hỗn hợp còn tạo điều kiện cho sự lên men malolactic xảy ra đồng thời với lên men rượu, nếu lên men malolactic không xảy ra
tức thời thì có thể là do tỉ lệ vi khuẩn trong dịch lên men quá ít hoặc do hàm lượng SO2 quá cao đã ức chế vi khuẩn [2].
Tuy nhiên, phương pháp này cũng có hạn chế: đó là là sự cạnh tranh khơng lành mạnh chất dinh dưỡng và quan hệ đối kháng giữa vi khuẩn và nấm men. Sự chuyển hóa đường của vi khuẩn lactic để sinh ra axit lactic gây ảnh hưởng đến hiệu suất quá trình lên men rượu của nấm men và chất lượng rượu vang. Bên cạnh đó, khi vi khuẩn lactic phát triển mạnh sinh ra quá nhiều axít lactic và axetic gây ra sự mất cân bằng vị trong rượu vang làm mất giá trị cảm quan của sản phẩm. Phương pháp này chỉ thực hiện khi các chủng vi sinh vật đã được lựa chọn kĩ, khơng có tính đối kháng và lượng tế bào cần có của mỗi chủng được xác định. Do vậy, phương pháp lên men hai giai đoạn đã được tiến hành[7].
Lên men hai giai đoạn liên tiếp là quá trình lên men rượu và lên men malolactic riêng biệt. Sau khi lên men rượu bởi nấm men kết thúc, đưa vi khuẩn vào thực hiện giai đoạn lên men phụ (lên men malolactic). Phương pháp này có ưu điểm sau: Cho phép điều chỉnh một cách dễ dàng các yếu tố mơi trường thích hợp cho từng loài, điều này giúp thời gian lên men của mỗi giai đoạn có thể rút ngắn khơng ảnh hưởng đến hiệu suất lên men rượu vì ni cấy hai chủng riêng, cuối q trình lên men, do nồng độ đường còn rất thấp nên lúc này vi khuẩn lactic buộc phải sử dụng các axit hữu cơ làm nguồn cơ chất chính để tồn tại. pH dịch lên men lúc này đã giảm còn khoảng 3.5 – 4, đây là khoảng pH thích hợp cho việc chuyển hóa axit malic nguy cơ đường bị chuyển hóa thành các sản phẩm khác như axit lactic, axit axetic giảm[7].
Nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là khi kết thúc lên men rượu nồng độ cồn trong mơi trường cao khoảng 12 – 15%v/v, do đó khi cấy vi khuẩn vào mơi trường do gặp nồng độ cồn cao đột ngột nên vi khuẩn sẽ bị sốc, số lượng giảm đáng kể nên sẽ làm chậm quá trình lên men malolactic. Do vậy mà phải chọn được các chủng vi khuẩn có khả năng chịu được độ cồn cao và dùng phương pháp nuôi cấy trước, tức là nuôi vi khuẩn trong các môi trường giàu dinh dưỡng có bổ sung cồn ở khoảng pH 4,5 trong 5 – 7 ngày để vi khuẩn thích ứng dần sau đó mới đưa
vào vang non, qua đó có thể khắc phục tình trạng chết của vi khuẩn một cách đáng kể. Trong thực tế, khơng có một phương pháp nào chung cho việc khởi động quá trình lên men malolactic, vì vậy khi đưa một chủng vi khuẩn nào vào thực hiện quá trình này cần thiết phải xác định thời điểm bổ sung thích hợp chủng giống này.
CHƢƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, chủng vi sinh và hóa chất
2.1.1 Nguyên liệu
- Syro nho nhập khẩu của Ý có nồng độ chất khơ 65°Bx
- Chế phẩm Essential oenos (EO) do công ty Gusmer Enterprises cung cấp: là chế phẩm chứa chất dinh dưỡng cần cho sự sống sót của vi khuẩn malolactic, bao gồm các vitamin, các axit amin và muối khoáng.
- Enzym Pectinex Ultra SP-L và Pectinex 3XL của hãng NoVo (Đan Mạch), mua tại Công ty EAC (Việt Nam).
2.1.2 Vi sinh vật
- Chủng nấm men: Chủng nấm men S.cerevisiae SH09 phân lập tại Ninh Thuận
năm 2008.
2.1.3 Môi trường phân lập vi sinh vật
Môi trƣờng phân lập vi khuẩn lactic (MRS)
- ( NH4)3C6H7O5: 2g - CH3COONa:5g - Cao nấm men: 5g - Cao thịt:10g - CaH2PO4:2g - Glucoza:20g - Pepton:10g - MnSO4.4H2O:0,05g - Tween 80:1g - Thạch: 30g - Nước cất: 1000ml
Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn malolactic
Sử dụng mơi trường MRS có bổ sung axít malic: mơi trường MRS: 1 lít; axít malic: 5g; pH 5 (điều chỉnh bằng KOH 10N) và thạch: 30g.
Mơi trƣờng lên men malolactic nƣớc nho axít AG (Acide Grape) - Glucoza: 10g - Pepton: 10g - Cao nấm men: 5g - Axít malic: 2g - MgSO4.7H2O: 0,05g
- Nước nho: 250 ml, định mức bằng H2O cất đến 1000ml, điều chỉnh pH về 4,8
bằng KOH 10N.
2.1.4 Hóa chất
Các hố chất phân tích sử dụng của Merck (Đức), Sigma (Mỹ), BDH (Anh), A.R. (Trung Quốc) và bộ kít chuẩn enzyme (Cat.No.10139068035) của BOEHRINGER MANNHEIN (Đức).
2.1.5 Dụng cụ máy móc, thiết bị
Các dụng cụ, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu, phân tích của Viện Cơng nghiệp thực phẩm.
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1 Quy trình lên men rượu vang
Sy rô nho được pha với tỷ lệ 20%, sau đó bổ sung đường kính để đạt nồng độ chất khô 250 Bx. Lên men bằng chủng nấm men S.cerevisiae SH09. Kết thúc quá
trình này, tiếp tục lên men dịch trong vịng 10 ngày ở nhiệt độ 25°C, thu được rượu vang non. Bổ sung vi khuẩn malolactic (tỷ lệ giống 106
tế bào/ml) để tiến hành lên men malolactic.
Bổ sung vi khuẩn malolactic (tỷ lệ giống 106 tế bào/ml) để tiến hành lên men malolactic.
Mẫu ĐC: Lên men malolactic tự phát
Mẫu F: Lên men Malolactic, cấy vi khuẩn lactic ngay đầu quá trình lên men rượu. Mầu M: Lên men malolactic, cấy vi khuẩn lactic khi quá trình lên men rượu được 48h.
Mẫu E: Lên men malolactic, cấy vi khuẩn lactic khi quá trình lên men rượu vừa kết thúc.
2.2.2 Phương pháp vi sinh vật
- Phương pháp phân lập vi khuẩn malolactic từ nguồn nguyên liệu quả, lá nho
Hình 2.1 Sơ đồ phân lập vi khuẩn malolactic từ nguồn nguyên liệu quả và lá nho
- Phương pháp xác định khả năng lên men của chủng vi khuẩn malolactic
Lấy một đầu que cấy giống vi khuẩn malolactic từ khuân lạc trên đĩa petri hoặc ống thạch nghiêng rồi cấy vào 10-50 ml môi trường lên men malolactic dịch vang non sau khi lên men rượu của bộ môn thực phẩm và dinh dưỡng Viện Công nghiệp Thực phẩm cung cấp và lọc vô trùng bằng màng 0,45 micromet. Lên men ở nhiệt độ
250C. Lấy mẫu hàng ngày để kiểm tra hàm lượng axít malic bị tiêu thụ hoặc hàm lượng axít lactic tạo thành.
- Phương pháp xác định hình thái, kích thước tế bào và nảy chồi của các chủng vi khuẩn malolactic trên kính hiển vi.
- Phương pháp xác định số lượng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu đánh them phương pháp [1].
- Phương pháp xác định tế bào Gram + theo Collin, 1989 [15].
Phương pháp xác định vi khuẩn kỵ khí bằng khả năng tạo khuẩn lạc trên đĩa thạch MRS trong bình đã loại bỏ oxy [43].
- Phương pháp xác định vi khuẩn hiếu khí bằng khả năng sinh hoạt tính catalaza trên mơi trường thạch MRS [43].
- Phương pháp xác định khả năng phân giải CaCO3 của vi khuẩn malolactic: Mơi trường thạch MRS có bổ sung 20g/l CaCO3 được đổ vào các đĩa pettri.
Tiến hành đục lỗ trên các đĩa thạch với số lượng 3 lỗ/đĩa. Sau đó hút 30µl dịch vi khuẩn malolactic cho vào mỗi lỗ. Ủ các đĩa thạch ở nhiệt độ 37oC trong 3-5 ngày và quan sát vòng phân giải CaCO3 của vi khuẩn.
- Phương pháp xác định đặc tính lên men dị hình (khả năng sinh CO2) bằng ống Dulham theo Collin, 1989 [15].
Trong mơi trường lên men MRS có chứa glucoza trong ống nghiệm 10ml có chứa ống Dulham ở dưới đáy của ống nghiệm được cấy giống vi khuẩn lactic. Chủng nào sinh khí CO2 sau 24 - 48h sẽ tạo ra áp xuất đẩy ống thử dulham lên phía
trên bề mặt mơi trường trong ống nghiệm. Qua đó xác định được các chủng lên men di hình. Chủng nào khơng sinh khí sẽ khơng đẩy được ống thử Dulham lên phía trên bề mặt mơi trường trong ống nghiệm.
2.2.3 Phương pháp phân tích lý hóa
- Phương pháp đo pH
30 ml mẫu được được lấy ra cho vào cốc mẫu. Giá trị pH được xác định trực tiếp bằng pH metter (Máy đo pH 315i/SET, Đức).
Độ đục của mẫu được xác định bằng máy đo độ đục Turbidity (Italy).
- Phương pháp đo tỷ trọng: Tỷ trọng của dung dịch được xác định bằng thước đo tỷ trọng ở 200C.
- Xác định axít bay hơi.
Axít bay hơi được xác định bằng phương pháp của Zoecklein và cs (1989) [48]. 10 ml mẫu được cho vào bình Sellier. Sau khi cất, 100ml dung dịch chưng cất được chuẩn độ bằng NaOH 0,1 N.
Axít bay hơi được tính theo cơng thức sau đây:
Axít bay hơi (g axít axetic/l) = [ml NaOH x N x 0,06)/V] x 100 Trong đó: N: nồng độ của NaOH , V: thể tích mẫu (ml).
- Phương pháp phân tích axít tổng số.
Axít tổng số được xác định theo phương pháp của Zoecklein (1989). 10 mL mẫu được đun sôi trong 30 giây để loại bỏ C02. Sau đó 90 ml nước cất được thêm vào và sau đó chuẩn độ bằng NaOH 0,1 N.
Axít tổng số được tính theo cơng thức sau:
Axít tổng số (g axít tactaric/L) =[(mL NaOH X N X 0,075)/V] X 1000 Trong đó: N: nồng độ NaOH, V: thể tích mẫu (mL).
- Phương pháp phân tích etanol
Etanol được xác định bằng phương pháp cất trên thiết bị Distiller System (Đức), sau đó xác định độ cồn bằng alcohol metter.
- Xác định hàm lượng đường tổng số bằng phương pháp Graxianop [1]. - Phương pháp xác định đường sót: theo Nelson Somogy (1952) [36]. - Phương pháp xác định hàm lượng axít L-malic:
Hàm lượng axit L-malic được đo bằng phương pháp kít chuẩn enzym (BOEHRINGER MANNHEIN, Cat.No.10139068035).
- Phương pháp xác định SO2 tự do và SO2 tổng số [20]. - Phương pháp xác định diaxetyl: theo AOAC (1995) [9].
- Phương pháp phân tích các chất thơm furfural, cis-lacton, trans-lacton và anillin: bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS) [21].
- Xác định hàm lượng cồn theo TCVN 378:1986. Etanol được xác định bằng phương pháp cất trên thiết bị Distiller của Merck, sau đó xác định độ cồn bằng alcohol metter.
- Xác định hàm lượng axít L-malic, L-lactic và axít axetic bằng phương pháp kit chuẩn enzim (Boehringer Mánnhein, Đức).
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn malolactic cho sản xuất rƣợu vang
3.1.1 Phân lập các chủng vi khuẩn malolactic tại Ninh Thuận
Các vi khuẩn có khả năng phân giải axít malic trong rượu vang được gọi là vi khuẩn malolactic. Để phân lập được các chủng malolactic này, trước hết phải tiến hành phân lập sơ bộ có định hướng (vi khuẩn gram dương, catalaza âm tính, khả năng phân giải CaCO3,...) để thu nhận được các chủng vi khuẩn lactic, rồi tiếp theo xác định khả năng lên men malolactic của các chủng nhằm tìm ra chủng có đặc tính cơng nghệ phù hợp nhất cho lên men malolactic rượu vang đỏ.
Phân lập sơ bộ các chủng vi khuẩn lactic và có định hướng lên men malolactic từ lá và quả nho tại Ninh Thuận, kết quả được trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3.1. Đặc tính sinh lý của các chủng vi khuẩn lactic phân lập đƣợc Tên chủng Mầu sắc và hình dạng khuẩn lạc Hình dạng tế bào Phân giải CaCO3 Gram (+) NT1 Vàng nhạt, tròn, nhẵn, nhỏ Que ngắn, chuỗi 2, 3 tế bào + +
NT2 Trắng, trịn, xù xì, to Cầu nhỏ, chuỗi 2 tế bào + +
NT3 Trắng, tròn, gồ ghề, to Cầu, chuỗi 2 , 3 tế bào + +
NT4 Trắng, tròn, nhẵn, nhỏ Cầu nhỏ, chuỗi 2 tế bào + +
NT5 Trắng, tròn, gồ ghề, vừa Cầu to, chuỗi 2 tế bào + +
NT6 Trắng, tròn, nhẵn, to Que ngắn, chuỗi 2, 3 tế
Tên chủng Mâu săc và hình dạng khuẩn lạc Hình dạng tế bào Phân giải CaCO3 Gram (+)
NT7 Vàng nhạt, trịn, xù xì, vừa Que dài, chuỗi 2 tế bào + +
NT8 Trắng, tròn, nhẵn, nhỏ Cầu, chuỗi 3, 4 tế bào + +
NT9 Trắng nhạt, tròn, nhẵn, nhỏ Cầu, chuỗi 2, 4 + +
NT10 Trắng, tròn, nhẵn, nhỏ Cầu, chuỗi 2,4 tế bào + +
NT11 Trắng sữa, nhẵn, to Cầu, chuỗi 2 tế bào + +
NT12 Trắng, tròn, nhẵn, nhỏ Cầu, chuỗi 2, 3 tế bào + +
NT13 Trắng , tròn, nhẵn, nhỏ Que dài, chuỗi 2 tế bào + +
NT14 Trắng, tròn, nhẵn, nhỏ Cầu, chuỗi 3, 4 tế bào + +
NT15 Vàng, tròn, nhẵn, to Que ngắn, đơn bào + +
NT16 Vàng, trịn, xù xì, dẹt Que dẹt, đơn bào + +
NT17 Vàng, xù xì, nhỏ Que dẹt, chuỗi 2 tế bào + +
NT18 Trắng, xù xì, to Que ngắn, chuỗi 2 tế bào + +
NT19 Trắng, tròn, to Que, chuỗi 2, 4 tế bào + +
Kết quả bảng 3.1 cho thấy 20 chủng vi khuấn đều gram (+) và có vịng phân giải CaCO3 đã được phân lập. Trong đó, tương ứng với mỗi loại nguyên liệu là lá nho và quả nho. Các chủng này đều có hình thái khuấn lạc trịn, nhưng có bề mặt nhẵn hoặc xù xì, kích thước thay đổi từ nhỏ sang to và chủ yếu có mầu trắng. Hình