Phƣơng pháp nghiên cứu

a) Các bƣớc chuyển năng lƣợng b) Bƣớc chuyển phát huỳnh quang

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

Chọn mẫu thẻ FTA đã được lưu giữ và bảo quản

Mồi huỳnh quang đã được lựa chọn

Tách chiết mẫu bằng Chelex

PCR

Định lượng các mẫu khuôn ADN

Điện di acrylamide Điện di Agarose kiểm tra sản phẩm PCR Chọn sản phẩm PCR mang alen Tinh sạch sản phẩm PCR

Phối trộn tạo thang alen đơn

Phối trộn tạo thang alen phức

Nhân bội thang alen nhiều cấp

Kiểm tra tỷ lệ phối trộn

Kiểm tra tỷ lệ phối trộn Định lượng sản phẩm PCR

2.2.1. Phương pháp tách chiết ADN

Quá trình tách chiết ADN từ cỏc mẫu mỏu thu đƣợc trên thẻ bảo quản bằng Chelex bao gồm cỏc bƣớc:

 Lấy 1/4 vòng tròn vết máu trên thẻ cắt nhỏ cho vào ống eppendorf 1,5 ml vô trùng;

 Bổ sung 1ml đệm PBS hoặc nƣớc khử ion vô trùng;

 Vortex mạnh; ủ ở nhiệt đợ phịng 10 phút;

 Ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch và thu phần cặn giấy;

 Lặp lại 2 lần để loại bỏ hết huyết sắc tố của hồng cầu, các protein đã biến tính và các tạp chất;

 Bổ sung 200 l dung dịch chelex 5%;

 ủ hỗn hợp ở nhiệt độ 560C khoảng 30 phút;

 Vortex mạnh 10 giây và ủ hỗn hợp ở nhiệt độ 1000

C trong 8 phút;

 Vortex mạnh 30 giây. Ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 10 phút;

 Hút phần dịch trên chứa ADN cho sang ống eppendorf 0,5 ml mới;

 Bảo quản ở -200C hoặc có thể sử dụng ngay cho các phản ứng PCR.

2.2.2. Phương pháp định lượng ADN

Tại phịng thí nghiệm, chúng tơi sử dụng máy quang phổ kế NanoDrop cđa h·ng ThermoScientific để định lƣợng và kiểm tra độ tinh sạch của khuôn ADN sau tách chiết. Các bƣớc tiến hành đo nhƣ sau:

 Bật máy, chờ máy khởi động.

 Lựa chọn chế độ đo ssDNA (single strain DNA).

 Hiệu chỉnh: Hút 2l nuclease free water hoặc nƣớc khử ion vô trùng hoặc đệm pha loãng khuôn ADN bơm lên mắt đọc, đóng cánh tay của máy xuống, nhấn nút hiệu chỉnh (nút Blank).

 Sau khi hiệu chỉnh bằng mẫu nƣớc hoặc đệm, tiến hành đo đo mẫu:

- Dùng giấy mềm lau mắt đọc, hút 2l mẫu khuôn ADN cần định lƣợng và bơm lên mắt đọc, đóng canh tay của máy xuống, nhấn nút đo mẫu (Measure).

- Kết quả đƣợc hiển thị trong bảng với các thông số: Tên mẫu - Hàm lƣợng ADN (ng/l) - Chỉ số A260nm - Chỉ số A280nm - Chỉ số A260nm/280nm (OD).

- Lƣu kết quả đo vào dữ liệu phân tích.

2.2.3. Phương pháp nhân bội ADN

Dựa trên yêu cầu nghiên cứu, chúng tôi sử dụng các cặp mồi đã đƣợc sử dụng tại phòng thí nghiệm Cơng nghệ Gen và Vi sinh (P3 – Viện H57 – Tổng cục IV – Bộ Công an). Bộ mồi 05 locus STR Penta E, D18S51, D21S11, TH01 và D3S1358 đáp ứng các yêu cầu tƣơng thích, có hiệu suất cao, cho phép nhân bội đồng thời cả năm locus trong cùng một phản ứng PCR.

Chất huỳnh quang Fluorescein đƣợc lựa chọn cho nghiên cứu vì đây là chất huỳnh quang đƣợc sử dụng ở hầu hết các máy scanner và thiết bị giải trình tự tự đợng khác nhƣ FMBIO (Hitachi), Pharos FX plus (Bio-rad), ABI PRISMđ Genetic Analyzer (Applied Bio System), ngoài ra còn đƣợc sử dụng trong các bộ KIT thƣơng mại khác hiện đang đƣợc bán trên thị trƣờng nhƣ bộ KIT Power Plex 16 của Promega.

Kỹ thuật PCR nhân bội ADN đƣợc thực hiện với các điều kiện đã đƣợc tối ƣu tại phịng thí nghiệm, sử dụng chung cho 05 locus trong nghiên cứu nhƣ sau:

Bảng 5. Thành phần phản ứng nhân bội đơn locus Thành phần PCR Thể tích sử dụng Nồng độ cuối cùng dNTP 0,25 100 M Đệm PCR 2,5 1 X MgCl2 1 1 mM Mồi F + R 1 + 1 0,3M Taq – ADN polymerase 0,3 1,5U Khuôn ADN 3 10 – 20ng

Nuclease free water - -

Tổng V 25

Chu trình nhiệt sử dụng cho nhân bội các mẫu đơn locus nhƣ sau:

Bảng 6. Chu trình nhiệt nhân bợi đơn locus

Nhiệt độ o

C Thời gian Số chu kỳ

96 3 phút 1 94 1 phút 30 60 1 phút 72 1,5 phút 60 30 phút 1 4  -

2.2.4. Kỹ thuật điện di ADN

Đề tài sử dụng phƣơng pháp điện di trên gel agarose và gel poly acrylamide.

Điện di trên gel agarose

 Chuẩn bị gel agarose:

- Pha agarose 2% trong 1X TBE và đựng trong bình nón chịu nhiệt.

- Đun nóng cho agarose tan hoàn toàn.

- Rút lƣợc ra sau khi gel đã đông lại (khoảng 1h)

 Chạy điện di:

- Đặt bản gel vào buồng điện di theo phƣơng ngang với dịng điện mợt chiều, đổ đệm TBE 1X ngập bản gel.

- Trộn mẫu (khuôn ADN hoặc sản phẩm nhân bội) với đệm Glycerol theo tỷ lệ tƣơng ứng 15l khuôn ADN với 5l Đệm và 7l sản phẩm nhân bội với 2l Đệm.

- Cài đặt chế độ chạy điện di nhƣ sau:

 Điện di khuôn ADN: 110V trong 1h30’ đến 2h

 Điện di sản phẩm nhân bội: 110V trong 30 phút.

Điện di trên gel Poly acrylamide

 Chuẩn bị kính:

- Lau khn kính trơn bằng dung dịch bơi trơn;

- Lau bản kính dính bằng dung dịch bơi dính;

- Chèn spacer lên khn kính trơn để tạo khoảng cách giữa hai khn kính; Ghép bản kính dính vào khn kính trơn;

- Cố định khn bằng giá kẹp hai bên khuôn;

- Lắp lƣợc và lắp chụp đáy cao su để tạo khuôn gel hoàn chỉnh;

- Đặt khuôn gel lên giá và chỉnh cân bằng.

 Chuẩn bị gel

- Pha gel gồm hỗn hợp các dung dịch gel poly acrylamide 6%, APS và TEMED;

- Dùng xilanh hút dung dịch gel đã pha và bơm vào khuôn gel theo lỗ dƣới đáy khuôn;

- Để gel đơng trong vịng 1h.

 Chuẩn bị mẫu:

- Biến tính mẫu: Đặt mẫu vào máy gia nhiệt ở 95oC trong 5 phút và cho ngay lên khay đá lạnh.

 Chạy điện di:

- Đặt khuôn gel vào bồn điện di, lặp các điện cực và cắm hai đầu dây điện cực vào nguồn;

- Đặt chế độ để chạy khơng tải bản gel trong vịng 1h để bản gel đạt nhiệt độ khoảng 45o

C;

- Khi bản gel đạt nhiệt độ cần thiết, gỡ nắp khuôn gel, và nạp mẫu vào giếng.

- Sau khi nạp mẫu, lắp lại nắp khuôn gel, đặt chế độ chạy điện di trong vòng 2h30 phút.

- Kết thúc chạy điện di, tháo khuôn gel ra khỏi bồn điện di, nhẹ nhàng tách bản kính dính ra khỏi khn kính trơn.

- Đặt bản kính dính (có dính lớp gel poly acrylamide) vào bồn rửa sạch và rửa bằng nƣớc khử ion để loại bỏ đệm dƣ và cặn bẩn.

2.2.5. Phương pháp phát hiện ADN sau điện di

2.2.5.1. Phát hiện băng ADN bằng Ethidium bromide

Trong nghiên cứu, phƣơng pháp nhuộm Ethidium bromide đƣợc sử dụng để kiểm tra khuôn ADN sau tách chiết.

 Quá trình điện di và kiểm tra sản phẩm PCR:

- Gel đƣợc đặt nằm ngang trong buồng điện di có chứa dung dịch đệm;

- Điện di thực hiện theo phƣơng nằm ngang với dòng điện mợt chiều;

- Q trình điện di trên gel agarose đƣợc thực hiện với điều kiện;

- Điện áp: 110V;

- Thời gian khoảng 1-2h (đối với các mẫu khuôn ADN tổng số sau tách chiết) và khoảng 20 phút (đối với các mẫu sản phẩm PCR);

- Đặt bản gel sau điện di vào khay chứa Ethidium bromide 10mg/ml. (Có thể đặt trên máy lắc để tăng hiệu quả nhuộm);

- Sau khi nhuộm, rửa bản gel bằng đệm TBE 1X hoặc nƣớc khử ion;

- Đặt bản gel đã rửa lên hệ thống soi UV; hoặc có thể dử dụng hệ thống scan huỳnh quang Pharos FXTM

Plus Molecular Imager với bƣớc sóng sử dụng là 532nm

- Chụp ảnh bản gel trên hệ thống soi để lƣu lại hình ảnh. 2.2.5.2. Phát hiện băng ADN bằng kỹ thuật soi gel huỳnh quang

áp dụng phƣơng pháp đánh dấu huỳnh quang sản phẩm PCR thông qua mồi, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR sử dụng mồi gắn chất huỳnh quang FL để nhân bội các mẫu ADN. Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra kích thƣớc bằng gel agarose và kiểm tra kiểu gen bằng gel poly acrylamide. Bản gel đƣợc quét bằng nguồn lazer kích thích ở bƣớc sóng 488nm, các băng ADN phát quang sẽ đƣợc hệ thống phân tích ghi nhận và chuyển dữ liệu để phần mềm xử lý. Sử dụng hệ thống máy Pharos FXTM

Plus Molecular Imager để phân tích kết quả nghiên cứu sau điện di với các bƣớc tiến hành nhƣ sau:

 Sau khi điện di, bản gel đƣợc rửa bằng nƣớc khử ion trong vòng 2-3 phút để làm sạch đệm dƣ và các cặn bẩn bám trên gel;

 Đặt bản gel lên khay kính và đặt vào máy Pharos FXTM

Plus Molecular Imager;

 Thiết lập chế đợ soi gel tƣơng thích với chất huỳnh quang sử dụng cho mồi huỳnh quang (cụ thể là chế đợ qt Florophore, bƣớc sóng 488nm);

 Lựa chọn vùng quét cần thiết và quét lazer trên vùng gel đã lựa chọn;

 Sử dụng phần mềm Quantity One để phân tích hình ảnh sau khi qt;

2.2.6. Phương pháp chế tạo thang alen chỉ thị huỳnh quang

 Chế tạo thang alen đơn

- Tách chiết các mẫu mang alen từ thẻ bảo quản.

- Điện di Agarose kiểm tra khuôn sau tách chiết.

- Đo OD để xác định hàm lƣợng ADN trong các mẫu sau tách chiết.

- Tiến hành PCR nhân bội các mẫu mang alen sử dụng các cặp mồi huỳnh quang.

- Điện di Agarose kiểm tra kết quả PCR.

- Điện di khảo sát sơ bộ một số mẫu trên gel poly acrylamide để lựa chọn các mẫu mang alen phù hợp để chế tạo thang alen.

- Chọn mẫu mang alen cần thiết.

- Tinh sạch sản phẩm PCR, sử dụng bộ KIT “Wizard®SV Gel and PCR clean-up System” của hãng Promega.

- Đo hàm lƣợng sản phẩm PCR để xác định tỷ lệ trộn các mẫu.

- Tạo thang alen hỗn hợp có đầy đủ alen của mỗi locus bằng cách trộn lẫn các alen đã tinh sạch với nhau.

- Sử dụng hỗn hợp sau khi trộn làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR đơn cho mỗi locus, điện di kiểm tra tỷ lệ trợn thang alen thơng qua hình ảnh của các băng ADN.

- Sau khi thu đƣợc thang alen có tỷ lệ các băng tốt nhất, tiến hành nhân bội thang alen nhiều cấp.

 Chế tạo thang alen phức



Sau khi chế tạo thang alen đơn, tiến hành trộn các thang alen đơn theo tỷ lệ phù hợp để tạo thang alen phức. Thực hiện phản ứng PCR phức 05 locus trong cùng một phản ứng để nhân bội đồng thời thang alen của 05 locus nghiên cứu.

Bảng 7. Thành phần phản ứng nhân bội phức hợp 05 locus

Thành phần PCR Thể tích sử dụng Nồng độ cuối cùng

dNTP 0,5 200 M

Đệm PCR 3 1,2 X

MgCl2 1,5 1,5mM

Mồi 05 locus

(Primer Mix ) 5 0,3 M each

Gold Taq – ADN

polymerase 0,6 3U

BSA (20mg/ml) 0.2 160 ng/ l

Khuôn ADN - 20 ng

Nuclease free water - -

Tổng V 25

B¶ng 8. Chu trình nhiệt nhân bội phức hợp 05 locus

Nhiệt độ O