Chế phẩm sinh học là sản phẩm của q trình bổsung sinh khối vi sinh vật, có thểbao gồm 1 chủng hoặc nhiều chủng trộn với chất mang, đƣa vào hệ thống xử lý đểcải thiện hiệu quả xử lý và giải quyết các sựcốbất ngờ về vi sinh của hệ thống.
Nhiều loại chất mang đã đƣợc nghiên cứu và sử dụng nhƣ: cao lanh, trấu, tro, khoáng sét, ... Chất mang có chức năng chính là vật liệu bám dính cho các tế bào vi sinh vật, tạo điều kiện cho quá trình lƣu trữ và bảo quản. Các chất mang khác nhau thì sự kết dính của chúng với vi sinh vật cũng khác nhau. Hiện nay, cao lanh là chất
mang đƣợc sửdụng phổ biến với các đặc tính nhƣ có diện tích bềmặt lớn, độ bền nhiệt cao, độkhuếch tán tốt, trơ hóa học và khả năng kết lắng tốt [35,41].
Các tế bào vi sinh có thểbám dính lên bề mặt chất mang phụ thuộc vào độ bám dính của các vi khuẩn (trạng thái sinh lý của tế bào), ái lực của chất mang với vi khuẩn (các lực nhƣ liên kết hydro, lực Van Der Waals) và các điều kiện vật lý nhƣ nhiệt độ sấy, tỷlệ phối trộn, pH.
Vi sinh vật trong chế phẩm sinh học giúp thúc đẩy quá trình phân hủy sinh học, đẩy nhanh q trình chuyển hóa các chất ơ nhiễm. Tuy nhiên, việc lựa chọn các chủng vi sinh vật bổ sung vào chế phẩm cần đƣợc xem xét cẩn thận, do các chủng này khi đƣa vào mơi trƣờng nƣớc thải có thểkhơng sinh trƣởng đƣợc hoặc khơng thể hiện đƣợc đặc tính do phải cạnh tranh với các chủng vi sinh vật bản địa, khơng thích nghi đƣợc với mơi trƣờng nƣớc thải (pH, nồng độ chất hữu cơ ô nhiễm, sự thay đổi tải trọng…). Vì vậy, khi bổ sung chế phẩm vào xử lý nƣớc thải cần xem xét bổ sung các chất dinh dƣỡng cần thiết cho sự kích thích qtrình sinh trƣởng của các chủng vi sinh vật. Tuy nhiên, việc này sẽ làm tăng chi phí xử lý và khơng thể chắc chắn về hiệu quả xử lý sau đó. Do đó, cần phải dựa vào đặc tính nƣớc thải và đặc tính của hệvi sinh vật để lựa chọn bổ sung các chủng vi sinh vật thích hợp.
Vi sinh vật bổ sung vào chế phẩm cần phải đáp ứng: có thể thực hiện q trình trao đổi chất sinh hóa các chất hữu cơ ơ nhiễm khi có các chất ô nhiễm gây ức chếkhác, sinh trƣởng mạnh mẽ và có sức cạnh tranh với các chủng vi sinh vật bản địa sau khi bổsung vào mơi trƣờng nƣớc thải và phải tƣơng thích với các chủng vi sinh vật cùng bổsung vào chế phẩm. Ngoài ra, các chủng vi sinh vật này không đƣợc gây bệnh cho ngƣời và gây hại cho hệsinh thái [20]. Do đó, mỗi chủng vi sinh vật cần đƣợc lựa chọn cẩn thận, phải trải qua khảo sát và thử nghiệm. Có một cách hiệu quả để việc lựa chọn các chủng vi sinh vật trở nên dễ dàng hơn: Lựa chọn các chủng vi sinh vật bản địa ngay từnguồn ô nhiễm cần xử lý. Các chủng này đƣợc phân lập từnguồn ô nhiễm, qua quá trình sàng lọc, tuyển chọn dựa trên các đặc tính phân hủy sinh học tốt nhất đáp ứng yêu cầu của từng hệ thống xử lý.
Trong các hệ thống xử lý có bổ sung chế phẩm sinh học, để duy trì hiệu suất xử lý, ngồi vấn đề lựa chọn đƣợc chủng vi sinh vật phù hợp, cần duy trì mật độ vi sinh vật trong chế phẩm. Mật độ vi sinh vật phải duy trì ở mức đủ lớn để có đƣợc hiệu quả phân hủy sinh học các chất ô nhiễm trong nƣớc thải tốt nhất.
Trong những năm gần đây, đã có nhiều cơng trình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật vào xử lý nƣớc thải, bƣớc đầu đã thu đƣợc kết quả đáng khích lệ, một số chế phẩm sinh học đang đƣợc sử dụng nhƣ:
Chế phẩm Biomidoli 2 phân giải cellulose của công ty TNHH Midoli. Thành
phần gồm: Trichodarma spp.,Cellulomonas spp.,Bacillus spp.,Thermoactynomyces
spp. với mật độ107 CFU/g.
Chế phẩm Bioproduct I đƣợc sản xuất từ một nhóm vi khuẩn Bacillus phân
lập từ nƣớc hồ, có tác dụng làm sạch nƣớc hồ bị ô nhiễm[7].
Chế phẩm TN2D do nhóm tác giả Võ Văn Nhân và cộng sự nghiên cứu với
thành phần: Bacillus subtilis (1012 CFU/g), Nitrosomonas spp. (1011 CFU/g),
Nitrobacterspp. (1011CFU/g), Saccharomyces (1012CFU/g), vi khuẩn phân giải lân
(1012 CFU/g), sử dụng xử lý nƣớc thải chế biến thủy sản [12].
Thực tế cho thấy, phần lớn các chế phẩm vi sinh xử lý nƣớc thải có thành phần vi khuẩn Bacillus.
Chƣơng 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Nƣớc thải sử dụng trong quá trình nghiên cứu là nƣớc thải lấy tại các bể cân bằng, bể vi sinh, bể lắng của hệ thống xử lý nƣớc thải nhà máy giấy An Hòa thuộc thơn An Hịa, xã Vĩnh Lợi, huyện Sơn Dƣơng, tỉnh Tuyên Quang và nƣớc thải chƣa qua xử lý của cụm công nghiệp giấy Phú Lâm thuộc thôn Tam Tảo, xã Phú Lâm, huyện Tiên Du, tỉnh Bắc Ninh.
Mẫu nƣớc thải đƣợc bảo quản ở 2oC – 4oC trong quá trình nghiên cứu.
2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 2.2.1. Thiết bị và dụng cụ 2.2.1. Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị và dụng cụ đƣợc sử dụng trong quá trình nghiên cứu là của Viện
Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm – Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội và phòng Thử nghiệm 1 – Công ty cổ phần Chứng nhận và Giám định VinaCert: Tủ cấy ESCO (Indonesia), tủ sấy Binder (Đức), nồi hấp Sturdy (Đài Loan), nồi hấp Hirayama (Nhật Bản), tủ ấm LabTech (Hàn Quốc), tủ ấm Memmert (Đức), tủ ấm lạnh Memmert (Đức), bể ổn nhiệt (Đức), máy quang phổ tử ngoại khả biến UV-VIS (Mỹ), máy lắc (Đài Loan), máy ly tâm lạnh (Đức), cân phân tích KERN (Đức),…
2.2.2. Hóa chấtvà mơi trƣờng
Hóa chấtvà mơi trƣờng
Hóa chất và thuốc thử sử dụng trong quá trình nghiên cứu bao gồm:
Merck: Cao thịt, K2HPO4, KH2PO4, (NH4)2SO4, CaCl2, NaCl, agar, lugol, bộ
nhuộm Gram, KOH, 1-Naphthol;MR-VP broth; blood agar…
Himedia: Peptone, cao nấm men, cellulose, D(+) xylose, D - lactose, ONPG,
thuốc thử Kovacs', creatin;triple sugar iron agar (TSI); ure agar; lysine decarboxylase (LDC); ornithine decacboxylase (ODC); arginine dihydrolase (ADH); tryptophan; carbohydrateconsumption broth (CCB);simmons citrat agar…
Trung Quốc:K2Cr2O7,Ag2SO4,HgSO4, H₂SO₄đặc, FeSO₄.7H₂O, H2O2,
[(NH₄)₂Fe(SO₄)₂.6H₂O],MgSO4.7H2O, D- glucose, D- mannitol, sucrose, ure,…
Thành phần của một số môi trƣờng
Môi trƣờngdinh dƣỡng lỏng (NB): Pepton 10 g/l,cao thịt 10g/l, NaCl 5 g/l, pH = 6,0 ± 0,2.
Môi trƣờng thạch dinh dƣỡng: Pepton 10 g/l, cao thịt 10 g/l, NaCl 5 g/l; agar
15 g/l, pH = 6,0 ± 0,2.
Môi trƣờng thạch Hans phân lập vi khuẩn phân giải cellulose: K2HPO40,5
g/l, KH2PO4 0,5 g/l, (NH4)2SO4 1,0 g/l, MgSO4.7H2O 0,1 g/l, CaCl2 0,1 g/l, NaCl 6,0 g/l,cao nấm men 0,1 g/l,cellulose 10,0 g/l,agar 15,0 g/l, pH = 6,0 ± 0,2.
Môi trƣờng thử hoạt tính cellulase ngoại bào: Cellulose 10,0 g/l,agar 15,0 g/l,
pH = 6,0 ± 0,2.
Mơi trƣờng thử sinh hóa:
MR-VP broth: Pepton 7 g/l, glucose 5 g/l, K2HPO4 5 g/l, pH = 6,9 ± 0,2. Blood agar: Pepton 20 g/l; NaCl 5 g/l, agar 15 g/l,pH = 7,3 ± 0,2.
TSI: Cao thịt 3 g/l, cao nấm men 3 g/l, pepton 20 g/l, NaCl 5 g/l, lactose 10 g/l, sucrose 10 g/l, glucoes 1 g/l, Sắt (III) xitrat 0,2 g/l, Natri thiosulphat 0,3 g/l, Phenol đỏ 0,024 g/l, agar 12 g/l, pH = 7,4 ± 0,2.
Ure agar: Pepton 1 g/l, glucose 1 g/l, NaCl 5 g/l, KH2PO4 2 g/l, phenol đỏ 0,012 g/l, agar 15 g/l, pH = 6,8 ± 0,2.
LDC: L-Lyzin monohydroclorua 5 g/l, cao nấm men 3 g/l, glucose 1 g/l, bromocresol đỏ tía 0,015 g/l, pH = 6,8 ± 0,2.
ODC: L-Ornithin monohydroclorua 5 g/l, cao nấm men 3 g/l, glucose 1 g/l, bromocresol đỏ tía 0,015 g/l, NaCl 10 g/l, pH = 6,8 ± 0,2.
ADH: L-Arginin monohydro clorua 5 g/l, cao nấm men 3 g/l, glucose 1 g/l, bromocresol đỏ tía 0,015 g/l, NaCl 10 g/l, pH = 6,8 ± 0,2.
Tryptophan: Trypton 10 g/l, NaCl 5 g/l, DL-Tryptophan 1 g/l, pH = 7,5 ± 0,2.
Carbohydrate consumption broth: Pepton 10 g/l, NaCl g/l, cao thịt 1 g/l, bromocresol tím 0,1 g/l, pH = 6,8 ± 0,2.
Simmons Citrat Agar: MgSO4 0,2 g/l, NH4H2PO4 1 g/l, K2PO4 1 g/l, NaCl 5 g/l, Na3C6H5O7 1 g/l, Bromothymol xanh 0,08 g/l, agar 15 g/l, pH = 6,8 ± 0,2.
Các môi trƣờng hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phƣơng phân tích xác định các thông số chất lƣợng nƣớc thải 2.3.1.1. Xác định pH 2.3.1.1. Xác định pH
pH đƣợc xác định trên máy Hanna HI 2550. Trƣớc khi đo pH trên mẫu, tiến
hành hiệu chuẩn đầu điện cựcbằng các dung dịch đệm hiệu chuẩn, trƣớc mỗi lần thực hiện cần vệ sinh đầu điện cực và đầu dò nhiệt độ bằng nƣớc cất hoặc nƣớc đã loại ion[23].
2.3.1.2. Xác định COD
Hút 2ml mẫu (pha lỗng nếu cần) vào bình phản ứng, thêm 1 ml K2Cr2O7và thêm 3 ml dung dịch H2SO4 - Ag2SO4, đậy kín và lắc đều.
Phá mẫu ở 150oC trong 2 giờ. Mẫu sau khi phá, để nguội, thêm 1- 2 giọt chỉ
thị Feroin và tiến hành chuẩn độ lƣợng dƣ dicromat trong mẫu bằng muối Mohr ((NH4)2Fe(SO4)2.6H2O) nồng độ 0,12 mol/l.
Dừng việc chuẩn mẫu khi thấy dung dịch chuyển từ màu xanh lá sang màu
đỏ gạch. Ghi lại thể tích muối Mohr tiêu tốn.
Mẫu trắng: sử dụng nƣớc cất. Tiến hành tƣơng tự nhƣ trên
Xác định COD bằng công thức:
COD = 8000c.(V1−V2)V0
Trong đó:
COD: nhu cầu oxi hóa học, mg/l;
c là nồng độ của sắt (II) amoni sunfat, mol/l; V0 là thể tích của phần mẫu thử, ml;
V1 là thể tích sắt (II) amoni sunfat sử dụng khi chuẩn độ mẫu trắng, ml; V2 là thể tích sắt (II) amoni sunfat sử dụng khi chuẩn độ mẫu thử, ml; 8000 là khối lƣợng mol của ½ O2, tính bằng mg/l [22].
2.3.1.3. Hàm lƣợng các chất rắn lơ lửng
Sấy giấy lọc ở 105oC, trong 1 giờ, cân và ghi khối lƣợng cân của giấy lọc sau
khi sấy.
Để mẫu đạt nhiệt độ phòng, lắc đều để đồng nhất mẫu.
Sau khi mẫu đã đồng nhất, lấy 20 ml mẫu lọc qua giấy lọc, tráng ống đong bằng 20 ml nƣớc cất và dùng lƣợng nƣớc này để rửa giấy lọc.
Sấy giấy lọc sau khi lọc ở 105oC ± 2oC từ 1 giờ đến 2 giờ. Cân và ghi lại
khối lƣợng giấy lọc
Hàm lƣợng chất rắn lơ lửng (TSS), tính theo cơng thức:
V a b p 1000( ) Trong đó: p (TSS): hàm lƣợng chất rắn lơ lửng, mg/l; b:khối lƣợng giấy lọc sau khi lọc, mg; a: khối lƣợng giấy lọc trƣớc khi lọc, mg; V: thể tích mẫu, ml[24].
2.3.1.4. Chỉ số thể tích bùn
Mẫu cho vào ống đong 1 lít, để lắng 30 phút, ghi thể tích bùn cịn lại (V ml).
Sau đó lấy 1 lít nƣớc đó đi xác định TSS và đƣợc tính nhƣ sau:
𝑆𝑉𝐼 =𝑉. 1000 𝑇𝑆𝑆
Trong đó:
SVI: Chỉ số thể tích bùn, ml/g;
V: Thể tích chất rắn lắng sau 30 phút trong ống đong 1 lít; TSS: Hàm lƣợng chất rắn của mẫu, mg/l;
1000: Hệ số quy đổi miligam ra gam[32].
SVI trong khoảng 80 – 120 ml/g là tốt nhất[36].
2.3.2. Phƣơng pháp phân lập các chủng vi khuẩn
Từ các mẫu nƣớc thải, lấy 50ml cho vào bình tam giác 250ml chứa 50ml môi
Xử lý mẫu trên ở 80oC trong 20 phút, sau đó để mẫu về nhiệt độ phịng và tiến hành pha loãng mẫu bằng cách: Hút 1ml mẫu cho vào 9ml môi trƣờng pha
loãng NaCl 0,85% đƣợc dung dịch mẫu ở độ pha loãng 10-1, tiến hành tƣơng tự để
thu đƣợc các độ pha loãng tiếp theo, pha loãng đến 10-4[21].
Lấy 0,1 ml mẫu ở các độ pha loãng trên cấy chang lên môi trƣờng chọn lọc
Hans[20], mỗi độ pha lỗng lặp lại 2 lần, sau đó ni ủ các mẫu ở 35oC trong 48
giờ. Sau thời gian nuôi ủ, chọn, nhận dạng các chủng riêng biệt, cấy ria trên môi trƣờng Hans đến khi thu đƣợc chủng thuần khiết[20].
Nhận diện, phân loại sơ bộ các loài vi khuẩn qua đặc điểm hình thái [5].
2.3.3. Phƣơng pháp tuyển chọn chủng có hoạt tính cellulase
Tuyển chọn chủng có hoạt tính cellulase bằng phƣơng pháp cấy chấm điểm,
đục lỗ thạch [30] và xác định hoạt lực enzyme[34].
Phƣơng pháp cấy chấm điểm: Cấy chấm điểm các chủng trên môi trƣờng
Hans nuôi ở 35oC trong 48 giờ.Sau thời gian nuôi, để đĩa Petri vào tủ lạnh trong 12
giờ. Sau đó cho vào tủ ấm 40oC trong 6 giờ. Lấy ra, cho vào mỗi đĩa Petri 5 ml
thuốc thử lugol, dàn đều khắp mặt thạch; để trong 15 phút rồi gạn bỏ hết thuốc thử và đo kích thƣớc vịng phân giải[20].Tính tỷ số giữa đƣờng kính vịng phân giải (D1) và đƣờng kính khuẩn lạc (d1).
Phƣơng pháp đục lỗ thạch: Các chủng đƣợc chọn tăng sinh trên môi trƣờng
lỏng NB bổ sung thêm cellulose 1%, nuôi 48 giờ ở 35oC. Sau thời gian nuôi, đem ly
tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch trong phía trên. Hút 100µl dịch trong thu đƣợc sau ly tâm của mỗi chủng cho vào từng giếng (đƣờng kính giếng d2 = 8mm) trên mơi trƣờng thử hoạt tính cellulase ngoại bào. Nuôi các đĩa thạch này ở 35oC trong vịng 48h. Sau đó tiến hành nhuộm lugol và tính hiệu số giữa vịng phân giải D2 và đƣờng kính giếng d2.
Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzymecellulase: Xác định dựa vào lƣợng đƣờng khử tạo thành sau phản ứng bằng phƣơng pháp đo quang phổ theo Miller[34]:
- Cơ chất đƣợc chuẩn bị bằng cách: cân chính xác 0,1 g cellulose, hòa tan cùng với nƣớc,định mức 100ml và lắc đều. Sau đó hút 150μl cellulose và 150 μl
dịch enzymemẫu cho vào ống eppendorf, lắc đều và ổn nhiệt ở 50oC trong 10 phút,
bổ sung thêm 600 μl DNS, để trong nƣớc đang sơi nhiệt độ 95-100oC trong vịng 5
phút. Mẫu kiểm chứng chuẩn bị tƣơng tự nhƣ trên, tuy nhiênenzyme sẽ bị bất hoạt
bằng cách cho luôn hỗn hợp cellulose và enzymevào nƣớc ở 95-100oC. Làm nguội
các mẫu bằng nƣớc lạnh và xác định giá trị OD540nm. Dựa vào đƣờng chuẩn để tính lƣợng đƣờng C có trong mẫu. Hoạt độ enzyme đƣợc xác định theo công thức:
E= C.1000.V.f180.V'.t
Trong đó:
C là nồng độ đƣờng tƣơng ứng mà enzyme phân cắt, mg/ml V là tổng thế tích enzyme và cơ chất tham gia phản ứng, ml V’ là thể tích dịch enzyme tham gia phản ứng, ml
f là hệ số pha loãng
t là thời gian phản ứng của cơ chất và enzyme, phút 180 là khối lƣợng mol của glucose, g/mol.
- Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng bằng cách : Cân chính xác 0,1 g glucose ịa tan bằng nƣớc cất và định mức 100ml. Pha loãng dung dịch glucose bằng nƣớc cất để nồng độ đạt đƣợc là 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,6 mg/ml. Hút 300 μL glucose ứng với mỗi nồng độ glucose trên và thêm vào lần lƣợt các ống eppendorf 600 μL. Lắc đều để đảm bảo glucose phản ứng hoàn toàn với
DNS. Để trong nƣớc sơi với nhiệt độ 95-100oC trong vịng 5 phút. Làm nguội các
mẫu bằng nƣớc lạnh và xác định giá trị OD540nm.
2.4.Định danh vi khuẩn
2.4.1. Phƣơng pháp định danh dựa trên đặc tính sinh lý, sinh hóa
Mỗi loại vi khuẩn có các phản ứng hóa sinh đặc trƣng, dựa trên cơ sở này để chọn lọc sơ bộ các chủng phân lập.
Phƣơng pháp nhuộm Gram: Gram vi khuẩn đƣợc xác định dựa trên sự bắt màu thuốc nhuộm của tế bào vi khuẩn. Cấu trúc thành tế bào của mỗi vi khuẩn khác nhau nên khả năng bắt màu cũng khác nhau , vi khuân Gram (+) bắt màu tím và Gram (–) bắt màu hồng[21].
Khả năng sinh bào tử của vi khuẩn: đƣợc xác định bằng cách xử lý nhiệt ở 70oC trong 20 phút. Các vi khuẩn có khả năng sinh bào tử và các vi khuẩn chịu nhiệt đƣợc giữ lại.
Các tính chất sinh hóa:
- Catalase: Lấy khuẩn lạc cần kiểm tra hòa vào một giọt dung dịch hydro
peroxit trên lam kính. Kiểm tra sự hình thành bọt khí. Nếu quan sát thấy sủi bọt thì vi khuẩn phản ứng dƣơng tính catalase, ngƣợc lại là phản ứng âm tính với catalase.
- Oxidase:Dùng đũa thủy tinh lấy một phần khuẩn lạc cấy lên đĩa giấy đã tẩm
thuốc thử oxidase. Sau 10 giây, quan sát kết quả, phép thử đƣợc coi là dƣơng tính nếu đĩa giấy chuyển sang màu tím hoa cà, màu tím hoặc tím sẫm.
- Di động:Cấy đâm sâu vi khuẩn vào môi truờng thạch di động, ủ ở 25oC ±
1oC trong 48 giờ.Kiểm tra kiểu mọc xung quanh vết cấy, chủng di động khi vết cấy
mọc lan. Nếu mọc chƣa đủ, thì ni thêm 5 ngày và kiểm tra lại vết cấy.