2.1.1. Mẫu ruột gà
Gà được lựa chọn từ các vùng Bắc Ninh, Mê Linh, Phú Thọ, Thanh Hóa và Cao Bằng. Tất cả các loại gà này đều được chăn thả và ăn thức ăn tự nhiên (không chứa các probiotic thương mại). Sau khi lựa chọn được các giống gà, gà được giết mổ, lấy ruột. Ruột được bảo quản trong nước muối sinh lí.
2.1.2. Các chủng vi khuẩn tham chiếu
Trong đề tài này chúng tơi đã sử dụng một số lồi vi khuẩn tham chiếu sau: Bacillus indicus HU36: Chủng vi khuẩn sắc tố màu vàng cam
sinh carotenoid được phân lập từ phân người, được cung cấp bởi Giáo sư Simon Cutting, Đại học Hồng gia Holloway, Ln Đơn, Anh Quốc.
Bacillus subtilis HU58: Chủng vi khuẩn có khả chịu nhiệt cao,
sinh trưởng nhanh, được phân lập từ phân người, được cung cấp bởi Giáo sư Simon Cutting, Đại học Hoàng gia Holloway, Luân Đôn, Anh Quốc.
Bacillus subtilis PY79: Chủng vi khuẩn Bacillus subtilischuẩn
phịng thí nghiệm được cung cấp bởi Giáo sư Simon Cutting, Đại học Hồng gia Holloway, Ln Đơn, Anh Quốc.
Bacillus cereus:Chủng chuẩn được mua từ Viện Kiểm nghiệm
thuốc Trung ương, Việt Nam.
Probiotic có tên thương mại BioPlus YC (gồm 2 chủng B. subtilis DSM 5750 và B. licheniformis 5749) của hãng Chris Hasen, Đan
Mạch, nồng độ 1,6 x 109 CFU/g mỗi chủng.
2.1.3. Môi trường nuôi cấy
g/l Nutrient Broth 8 KCl 1 MgSO4.7H2O 0.25 ml/l Ca(NO3)2 1M 1 MnCl2 0.01M 1 FeSO4 1mM 1 pH 7,5
Luria Bertani (LB) 1% tinh bột (w/v) g/l Peptone 15 Yeast Extract 5 NaCl 5 Agar 16 Tinh bột 10 pH 7,5 LB bán lỏng Peptone 15 Yeast Extract 5 NaCl 5 Agar 1.5
31 pH 7,0
Thạch máu cừu (Tryptose Blood Agar) được cung cấp bởi công ty Nam Khoa Thạch sữa gầy 5% (w/v)
Bột sữa gầy 50
Agar 18
Tryptic Soya Borth (TSB)
TSB 30
pH 7,5
Tryptic Soya Borth Agar (TSA)
TSB 30
Agar 16
pH 7,5 Nutrient Agar (NA)
Nutrient Broth 8 Agar 16 pH 7,0 VP Test: Pepton 7 NaCl 5 Glucose 5 pH 7,5 CM Agar: Casein digest 30 D-mannitol 10
Agar 10 pH 7,5
Môi trường thạch Simmons citrat: Sodium citrat 2 NaCl 5 MgSO4 0,2 NH4H2PO4 1 K2HPO4 1 Bromothymol blue 0,08 Agar 18
Môi trường thạch gelatin:
C% Gelatin 12 Peptom 1 Cao nấm mem 0,5 NaCl 0,5 pH 7,0
2.1.4. Hóa chất sinh học phân tử
Tất cả các hóa chất dùng trong sinh học phân tử đều được cung cấp bởi các hãng nổi tiếng trên thế giới như Enzyomics, Promega, Bio Basic, Merck Millipore, Thermo Sicentific, Sigma-Aldrich,...
Để tách chiết, khuếch đại cũng như tinh sạch DNA cần sử dụng các hóa chất như: Protease K (20 mg/ml), Ethanol, nước khử ion khử trùng, Lysozyme, Hot Taq, Taq Buffer, Taq Polymerase, Tris Base, dNTPs, Agarose. Cặp mồi đề khuếch đại đoạn gen mã hóa 16S rRNA là 27F:5'- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG- 3' và 1527R:5'- AAAGGAGGTGATCCAGCC- 3’, 1527R.
33
Trong khi để phân biệt các chủng bằng kỹ thuật PCR-RFLP, các hóa chất cần thiết bao gồm: Albumin huyết thanh bò (BSA), enzyme giới hạnAfl II và Alw26 I.
2.1.5. Các hóa chất khác
Để phân lập và xác định tính chất các chủng vi khuẩn, các hóa chất phổ biến như: Nước muối sinh lí ( NaCl 0.9%), tinh bột, gelatin, casein, nước cất vô trùng, thuốc thử Lugol, KOH 40%, α- napthol, kháng sinh dạng khoanh giấy, HCl, MgSO4, NH4H2PO4, K2HPO4, Bromothymol blue.
2.1.6. Dụng cụ và thiết bị
Dụng cụ:
Que cấy, đĩa petri, bình tam giác, ống nghiệm, đầu côn, ống Eppendorf, ống PCR, ống falcol, pipetman (Eppendorf), giá để ống falcol, ống Eppendorf .
Thiết bị:
Tủ cấy vô trùng (Air tech), tủ ấm (Memmert), tủ sấy (Memmert), máy lắc, máy li tâm 5417C (Eppendorf), Microscope (Carl Zeiss), Biomate 3 (Thermo Sicentific), Heat Block, Electrophoresis (Bio-science), Minispin (Eppendorf), Gradient PCR machine (Eppendorf), Gel Doc X (Bio-Rad), đèn cồn, thước đo điện tử, tủ lạnh, lị vi sóng, tủ lạnh sâu( bảo quản mẫu ở -800C).