Sự cô đặc chromatin và sự phân mảnh DNA là đặc điểm đặc trưng của quá trình apoptosis [41]. Để làm rõ hơn quá trình apoptosis của tế bào MCF7 sau khi xử lý với cao chiết, phương pháp nhuộm kép AnnexinV-FITC và PI được sử dụng để phân biệt tế bào sống, tế bào apoptosis sớm, tế bào apoptosis muộn hoặc tế bào chết bằng kỹ thuật FACS (Hình 3.8). Đối với nhóm đối chứng, kết quả cho thấy 2,02 ± 0,61% tế bào chết ở nhóm tế bào đối chứng. Tỷ lệ tế bào apoptosis là 9,56 ± 2,04%, 18,25 ± 2,41% và 25,56 ± 4,13% tương ứng với tế bào MCF7 được xử lý với cao chiết ở các nồng 50 µg/ml, 75 µg/ml, 100 µg/ml (Hình 3.8). Trong khi đó, tỉ lệ tế bào apoptosis là 32,46 ± 3,02% khi tế bào được xử lý với Etoposide. Như vậy, kết quả cho thấy cao chiết cảm ứng apoptosis trên các tế bào MCF7 phụ thuộc vào nồng độ sử dụng.
Hình 3.8. Ảnh hưởng của cao chiết cây Lan Kim Tuyến lên sự cảm ứng apoptosis của tế bào ung thư vú. Tỉ lệ apoptosis trên tế bào ung thư MCF7 sau khi được xử lý với cao chiếtở các nồng độ khác nhau sau 48 giờ. Tỉ lệ apoptosis của tế bào MCF7 được xác định bằng phương pháp nhuộm kép Annexin V- FITC/PI và phân tích trên hệ thống máy FACS. Mỗi biểu đồ gồm 4 ô: ô góc phần tư thứ 1 (tế bào sống); ô góc phần tư thứ 2 (tế bào apoptosis sớm); ô góc phần tư thứ 3 (tế bào apoptosis muộn) và ô góc phần tư thứ 4 (tế bào necrosis). Đồ thị biểu diễn tỉ lệ apoptosis của tế bào MCF7 sau khi xử lý với cao chiết. Kết quả biểu thị bằng giá trị trung bình ± SD của ba lần lặp lại thí nghiệm. **p <0,01 và *p <0,05 khi so sánh với đối chứng.
Như vậy, ngoài việc đánh giá hiệu quả ức chế tăng sinh tế bào ung thư, kết quả nghiên cứu cũng chứng minh được cao chiết ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư vú thông qua sự cảm ứng apoptosis. Đây là một cơ chế cân bằng nội mô quan trọng đảm bảo sự hài hòa giữa sự phân chia tế bào và sự chết của tế bào nhằm đảm bảo số lượng tế bào thích hợp trong mỗi cấu trúc mô [41]. Việc hoạt hóa apoptosis trong tế bào ung thư được xem là một trong các cách tiếp cận chính để điều trị ung thư. Apoptosis thường được đặc trưng bởi những thay đổi điển hình về mặt cấu trúc, bao gồm sự co lại tế bào, sự cô đặc của chromatin, sự phân mảnh DNA và sự dịch chuyển của phân tử Phosphatidylserine (PS) bên trong ra bên ngoài màng tế bào [42][43]. Trong nghiên cứu này, cao chiết cây
Lan Kim Tuyến gây ra hiện tượng apoptosis trong tế bào ung thư vú được xác định bởi sự cô đặc chromatin và sự phân mảnh DNA (Hình 3.7). Ngoài ra, sự dịch chuyển của phân tử PS ra bên ngoài màng tế bào cũng được phát hiện bằng phương pháp nhuộm kép Annexin V-FITC và PI. Sau đó, tỉ lệ tế bào apoptosis được xác định bằng kỹ thuật FACS (Hình 3.8).
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN
1. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần mẫu dược liệu Lan Kim tuyến: Đổ ẩm dược liệu: 13,27%, Độ tro của dược liệu: 7,03%, Thành phần sơ bộ một số nhóm chất gồm: triterpenoid, alkaloid, flavonoid, glycosid, chất khử và acid hữu cơ.
2. Dung môi nước là dung môi phù hợp cho quá trình chiết xuất thu nhận cao tổng từ cây Lan Kim Tuyến, với hiệu suất ly trích đạt 15,1 %, độ ẩm và hàm lượng flavonoid tổng của cao tổng đạt 18,86 % và 50,85 ± 3,84 µg QE/mg. Ngoài ra, nghiên cứu cũng đã tiến hành chiết xuất thành công các cao phân đoạn từ cao tổng nước cây Lan Kim Tuyến bằng các dung môi khác nhau, gồm cao phân đoạn n-hexan, cao phân đoạn etylacetat và cao phân đoạn n-butanol, với độ ẩm các phân đoạn cao nằm trong giới hạn cho phép. Trong đó, cao phân đoạn etylacetat có hàm lượng flavonoid cao nhất 61,10 ± 5,15 µg QE/mg.
3. Cao chiết cao chiết cây Lan Kim Tuyến ức chế mạnh sự tăng sinh của tế bào ung thư vú MCF7 và BT474 phụ thuộc vào nồng độ cao xử lý. Giá trị IC50 của cao chiết được xác định trên tế vào MCF7 và BT474 lần lượt là 82,56 μg/ml và 95,02 μg/ml sau 48 giở xử lý. Các kết quả định lượng hàm lượng enzyme LDH, khả năng hình bào bào lạc, sự thay đổi hình thái tế bào đều cho kết quả tương tự. Ngoài ra, cao tổng hay cao phân đoạn đều không gây độc hoặc ít gây độc trên 2 dòng tế bào thường nguyên bào sợi WS1 và NHDF
4. Cao chiết cây Lan Kim Tuyến cảm ứng apoptosis trên dòng tế bào ung thư vú MCF7. Tỉ lệ tế bào apoptosis tăng theo nồng độ cao chiết xử lý
4.2. KIẾN NGHỊ
Các nghiên cứu sâu hơn cần thực hiện để làm rõ vai trò của các đơn chất cũng như cao chiết cây Lan Kim Tuyếntrong việc ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư trên cả mô hình in vitro và in vivo.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.Schwartsmann G., Ratain M.J., Cragg G.M., Wong J.E., Saijo N., Parkinson D.R., Fujiwara Y., Pazdur R., Newman D.J., Dagher R., Di Leone L. Anticancer drug discovery and development throughout the world. Journal of Clinical Oncology, 2002, 20(18): 47-59.
2. Vickers A. Botanical medicines for the treatment of cancer: rationale, overview of current data, and methodological considerations for phase I and II trials. Cancer Investigation, 2002, 20(7-8): 1069-1079.
3. Martin K.P., Geevarghese J., Joseph D. and Madassery J. In vitro
propagation of Dendrobium hybrids using flower stalk node explants, Indian J. Exp. Biol. 2005, 43: 280285.
4. Hu S.Y. The Orchidaceae of China. Quarterly Journal of the Taiwan Museum. 1971, 4: 67˗ 103
5. Chiu N.Y., Chang K.H. Anoectochilus formosanus Hayata. In: The Illustrated Medicinal Plants of Taiwan. SMC Publishing Inc., Taipei, Taiwan.
1995,4: 282283
6. Kan W.S. Anoectochilus formosanus Hayata. In: Pharmaceutical Botany. National Research Institute of Chinese Medicine. Taipei, Taiwan, 1986.
7. Gutierrez R.M.P. Orchids: a review of uses in traditional medicine, its phytochemistry and pharmacology. J Med Plant Res. 2010, 4: 592638
8. He C.N., Wang C.L, Guo S.X., Yang J.S., Xiao P.G. Study on chemical constituents in herbs of Anoectochilus roxburghii II. China Journal of Chinese
Materia Medica, 2005, 30: 761-763.
9. He C.N, Wang C.L, Guo S.X., Yang J.S., Xiao P.G. A Novel Flavonoid Glucoside from Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl. Journal of Integrative Plant Biology, 2006, 48: 359-363
10.Liu B., Gao Y.Q., Wang X.M., Wang Y.C., Fu L.Q. Germacrone inhibits the proliferation of glioma cells by promoting apoptosis and inducing cell cycle
arrest. Mol Med Rep. 2014, 10(2):1046-1050
11.Huang L, Cao Y, Xu H Chen G. Separation and purification of ergosterol and stigmasterol in Anoectochilus roxburghii (wall) Lindl by high speed counter current chromatography. Journal of Separation Science, 2011, 34: 385-392 12.Wan T., Xiong F. Determination of kinsenoside in Anoectochilus roxburghi by HPLC-ELSD. Chinese Traditional Patent Medicine, 2014, 7.
13.Du X.M., Sub N.Y., Irino N. and Shoyama Y. Glycosidic constituents from
in vitro Anoectochilus formosanus. Chem Pharm Bull. 2000, 48: 18031804.
14.Du X.M., Sun N.Y., Tamura T., Mohri A., Sugiura M., Yoshizawa T., Irino N., Hayashi J. and Shoyama Y. Higher yielding isolation of Kinsenoside in
Anoectochilus and its anti-hyperliposis effect. Biol Pharm Bull. 2001, 24:
6569.
15.Lin C.C., Huang P.C., Lin J.M. Antioxidant and Hepatoprotective Effects of Anoectochilus formosanus and Gynostemma pentaphyllum. The American Journal of Chinese Medicine 2002, 28(1): 87-96
16.Wu J.B., Lin W.L., Hsich C.C., Ho H.Y., Tsay H.S. and Lin W.C. The hepatoprotective activity of kinsenoside from Anoectochilus formosanus.
Phytother Res. 2007, 21: 5861
17.Wang S.Y., Kuo Y.H., Chang H.N., Kang P.L., Tsay H.S., Lin K.F., Yang N.S., Shyur L.F. Profiling and characterization antioxidant activities in
Anoectochilus formosanus Hayata. J Agric Food Chem 2002, 5:1859–1865.
18.Cui S.C., Yy J., Zhang X.H., Cheng M.Z., Yang L.W., Xu J.Y. Anti- hyperglycemic and antioxidant activity of water extract from Anoectochilus roxb
urghii in experimental diabetes. Exp Toxicol Pathol. 2013, 65(5):485-488.
19.Zhang J.G., Liu Q., Liu Z.L., Li L., Yi L.T. Anti- hyperglycemic activity of Anoectochilus roxburghii polysaccharose in diabetic mice induced by high-fat diet and streptozotocin. J Ethnopharmacol. 2015,
164:180-185.
of Anoectochilus formosanus ameliorated thioacetamide-induced liver fibrosis in mice: The role ofKuppercells. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2010, 74(4):
781˗ 787
21.Shih C.C., Wu Y.W., Lin W.C. Aqueous extract of Anoectochilus formosanus attenuate hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride in rats.
Phytomedicine. 2005, 12(6-7):453-60
22.Yang Z. Protective effect of Anoectochilus roxburghii polysaccharide against CCl4-induced oxidative liver damage in mice. International Journal of Biological Macromolecules, 2017, 96: 442-450.
23.Zhang J.G., Liu Q., Liu Z.L., Li L., Yi L.T. Anti- hyperglycemic activity of Anoectochilus roxburghii polysaccharose in diabetic mice induced by high-fat diet and streptozotocin. J Ethnopharmacol. 2015,
164:180-185.
24.Tang T., Duan X., Ke Y., Zhang L., Shen Y., Hu B., Liu A., Chen H., Li C., Wu W., Shen L., Liu Y. Antidiabetic activities of polysaccharides from Anoectochilus roxburghii and Anoectochilusformosanus in STZ-induced diabetic mice. Int J Biol Macromol. 2018, 112:882-888.
25.Matsuda H., Ninomiya K., Morikawa T., Yoshikawa M. Inhibitory effect and action mechanism of sesquiterpenes from Zedoariae rhizoma on D- galactosamine/ lipopolysaccharide-induced liver injury. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1998, 8: 339–344.
26.Shyur L.F., Chen C.H., Lo C.P., Wang S.Y., Kang P.L., Sun S.J., Chang C.A., Tzeng C.M., Yang N.S. Induction of apoptosis in MCF-7 human breast cancer cells by phytochemicals from Anoectochilus formosanus. J Biomed Sci. 2004, 11(6):928-939
27.Tseng C.C., Shang H.F., Wang L.F., Su B., Hsu C.C., Kao H.Y., Cheng K.T. Antitumor and immunostimulating effects of Anoectochilus formosanus Hayata.
Phytomedicine. 2006, 13(5):366-70.
Kinsenoside, a high yielding constituent from Anoectochilus formosanus, inhibits carbon tetrachloride induced Kupffer cells mediated liver damage. J Ethnopharmacol. 2011, 135(2):440-449.
29.Yang Z. Protective effect of Anoectochilus roxburghii polysaccharide against CCl4-induced oxidative liver damage in mice. International Journal of Biological Macromolecules, 2017, 96: 442-450.
30.Huang L, Cao Y, Xu H Chen G. Separation and purification of ergosterol and stigmasterol in Anoectochilus roxburghii (wall) Lindl by high speed counter current chromatography. Journal of Separation Science, 2011, 34: 385-392 31.Wang L, Chen Q, Zhuang S, Wen Y, Cheng W, Zeng Z, Jiang T, Tang C. Effect of Anoectochilus roxburghii flavonoids extract on H2O2 - Induced oxidative stress in LO2 cells and D-gal induced aging mice model. J Ethnopharmacol. 2020 May 23;254:112670
32.Xiaoling Yu, Shouer Lin, Jinque Zhang, Liying Huang, Hong Yao, Shaoguang Li. Purification of polysaccharide from artificially cultivated Anoectochilus roxburghii(wall.) Lindl. by high-speed counter current chromatography and its antitumor activity. Journal of Separation Science. 2017 33.Le Dinh Chac, Bui Bao Thinh, Ha Thi Thanh Huong, Ngo Tuan Kiet, Le Quang Huan. Quantification of quercetin, isorhamnetin and ferulic acid in dry extract of Anoectochilus setaceus Blume from VietNam. International Journal of Botany Studies 2019, 4(5): 14-18
34.Đỗ Thị Gấm, Hà Việt Hải, Chu Hoàng Hà, Phạm Bích Ngọc. Khảo sát một số đặc điểm hóa học và tác dụng chống oxy hóa (antioxydant) của các hợp chất Flavonoid chiết xuất từ một số loài lan Kim tuyến của Việt Nam. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 2017, 33(1S): 104-113
35.Tran Minh Hoi, Tran Van Thai, Chu Thi Thu Ha, Ha Thi Van Anh, Phan Xuan Binh Minh and Nguyen Tien Dat. Flavonoids from Anoectochilus annamensis and their Anti-inflammatory Activity. Natural Product Communications 2016, 11(5): 613-614.
36.Geran RI, Greenberg NH, Macdonald MM, Shumacher AM, Abbott BJ. Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems (3rd edition). Cancer Chemoth Rep 1972; 3: 1–91.
37.Ho Y., Chen Y.F., Wang L.H., Hsu K.Y., Chin Y.T., Yang Y.S.H., Wang S.H., Chen Y.R., et al. Inhibitory Effect of Anoectochilus formosanus Extract on Hyperglycemia-Related PD-L1Expression and Cancer Proliferation. Front Pharmacol. 2018, 9:807
38.Weng, X.H., Wang, C.L., Yuan, X., Chen, W.J., 2011. Inhibitory effect of Anoectochilus formosanus polysaccharide on human prostate cancer PC-3 cell in vitro. Chin. J. Hosp. Pharm. 31, 1083–1087.
39.Jue, W.C., 2011. The extraction of volatile oil in Anoectochilus and its inhibition effect in lung cancer cell NCI-H446. Fujian Medical University,
Fujian
40.Shyur, L.F., Chen, C.H., Lo, C.P., Wang, S.Y., Kang, P.L., Sun, S.J., Chang, C.A., Tzeng, C.M., Yang, N.S., 2004. Induction of apoptosis in MCF-7 human breast cancer cells by phytochemicals from Anoectochilus formosanus. J. Biomed. Sci. 11, 928–939
41.Elmore S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicologic Pathology, 2007, 35(4): 495-516.
42.Hanahan D., Weinberg R.A. The hallmarks of cancer. Cell, 2000, 100: 57-
70.
43.Johnson V.L., Ko S.C., Holmstrom T.H., Chow S.C. Effector caspases are dispensable for the early nuclear morphological changes during chemical- induced apoptosis”, Journal of Cell Science, 200, 113: 2941-2953.
PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Kết quả xây dựng đường chuẩn định lượng flavonoid tổng và kết quả định lượng hàm lượng flavonoid tổng trong các mẫu cao chiết Lan Kim Tuyến
*: Ống 1, 2, 3, 4, 5, 6 tương ứng với các nồng độ kiểm tra 0, 2, 4, 6, 8, 10 µg/ml quercetin
Nồng độ thực tế Nồng độ kiểm tra OD415 nm Giá trị trung bình Giá trị sai số Lần 1 Lần 2 Lần 3 0 0 - - - - - 20 2 0,265 0,277 0,287 0,276 0,0110 40 4 0,577 0,598 0,59 0,588 0,0106 60 6 0,812 0,831 0,815 0,819 0,0102 80 8 1,124 1,068 1,052 1,081 0,0378 100 10 1,472 1,402 1,484 1,453 0,0443
Mẫu Giá trị OD Nồng độ thực tế TB SS
Lân 1 Lần 2 Lần 3 Lân 1 Lần 2 Lần 3
Cao ethanol 0,294 0,274 0,331 43,24 40,45 48,41 44,04 4,12 Cao nước 0,378 0,337 0,330 54,97 49,25 48,27 50.85 3.84 Phụ lục 2. Kết quả ảnh hưởng của cao chiết Lan Kim Tuyến lên tỉ lệ sống (%) của các dòng tế bào ung thư vú Tế bào MCF7 Đơn vị tính: % Nồng độ Tỉ lệ tế bào sống (%) Sai số 6h 12h 24h 48h 6h 24h 48h 72h 0 100 100,00 100,00 100,00 0,00 0,00 0,00 0,00 12,5 99,02 97,79 97,74 98,22 2,37 4,48 0,45 1,50 25 98,12 99,13 98,86 99,17 1,58 4,57 3,22 4,45 50 99,02 97,88 96,30 77,38 3,02 3,62 1,83 4,96 75 95,23 96,20 89,29 61,44 2,12 2,99 2,70 5,66 100 94,23 90,06 81,57 40,48 4,02 3,28 3,75 3,72 150 92,02 84,48 68,29 20,38 2,36 2,54 5,17 2,23 200 89,16 80,45 64,96 16,89 3,10 3,22 4,56 2,23
Tế bào BT474 Đơn vị tính: % Nồng độ Tỉ lệ tế bào sống (%) Sai số 6h 12h 24h 48h 6h 24h 48h 72h 0 100 100,00 100,00 100,00 0,00 0,00 0,00 0,00 12,5 99,67 98,67 96,91 98,76 2,37 3,70 3,67 2,62 25 98,12 97,23 95,41 98,67 1,58 3,54 5,93 4,69 50 97,25 96,68 94,31 89,15 3,02 5,32 2,79 4,48 75 98,21 95,95 89,51 60,47 2,12 4,07 3,14 3,37 100 95,23 91,80 84,66 47,26 4,02 3,92 3,10 2,94 150 95,02 85,11 82,43 24,93 2,36 3,59 4,77 3,66 200 92,31 83,53 71,89 18,35 3,10 2,00 3,78 2,52
Phụ lục 3. Kết quả ảnh hưởng của cao chiết Lan Kim Tuyến lên tỉ lệ sống (%) của các nguyên bào sợi Nguyên bào sợi WS1
Đơn vị tính: % Nồng độ Tỉ lệ tế bào sống (%) Sai số 12h 24h 48h 12h 24h 48h 0 100,00 100,00 100,00 0,00 0,00 0,00 12,5 101,65 100,20 95,88 3,81 2,36 3,54 25 95,42 97,27 92,23 5,64 4,55 0,44 50 97,28 96,42 98,89 6,12 4,55 4,83 75 92,38 95,13 83,55 0,66 7,50 4,39 100 96,21 92,62 80,57 6,81 4,46 2,42 150 90,53 92,22 71,67 3,01 6,33 6,62 200 82,41 76,39 64,62 5,16 7,50 4,09
Nguyên bào sợi NDHF Đơn vị tính: % Nồng độ Tỉ lệ tế bào sống (%) Sai số 12h 24h 48h 12h 24h 48h 0 0 100,00 100,00 100,00 0,00 0,00 12,5 12,5 98,74 99,16 95,83 3,81 2,36 25 25 97,49 101,57 94,29 3,64 3,55 50 50 98,36 100,78 94,16 2,12 4,55 75 75 94,45 96,17 90,14 4,66 5,50 100 100 92,71 94,35 84,28 3,81 4,46 150 150 91,97 90,35 80,25 4,01 3,33 200 200 89,88 83,73 68,34 5,16 4,50
Phụ lục 4. Kết quả ảnh hưởng của cao chiết Lan Kim Tuyến lên hàm lượng LDH trong môi trường nuôi cấy của tế bào ung thư vú Tế bào MCF7 Đơn vị tính: lần Lần Đối chứng 6.25 µg/ml 12.5 µg/ml 25 µg/ml 50 µg/ml 75 µg/ml 100 µg/ml H2O2 1 1 1,03 0,94 1,26 1,42 2,40 2,63 3,00 2 1 1,00 1,02 0,98 1,77 2,18 2,24 2,84 3 1 0,94 1,11 1,27 1,50 2,22 2,45 3,21 TB ± SS 1,00 ± 0,00 0,99 ± 0,05 1,02 ± 0,09 1,17 ± 0,16 1,56 ± 0,18 2,27 ± 0,12 2,44 ± 0,20 3,02 ± 0,19 Tế bào BT474 Đơn vị tính: lần Lần Đối chứng 6.25 µg/ml 12.5 µg/ml 25 µg/ml 50 µg/ml 100 µg/ml 150 µg/ml 200 µg/ml