Các hóa chất được mua từ các hãng: Fisher, Acros, Merck, Aldrich-Sigma, Xilong, Chemsol và sử dụng trực tiếp không qua tinh chế lại (bảng 2.1).
Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng trong quá trình tổng hợp
Hóa chất Xuất xứ Độ tinh khiết (%)
o-Phenylen diamine Acros 98
3,4-Diaminotoluene Acros 97
3,4-Diaminobenzophenone Merck 99
4-Chloro-benzene-1,2-diamine Acros 97
4,5-Dichloro-o-phenylenediamine Acros 98
Salycilic aldehyde Acros 99
3-Hydroxybenzaldehyde Acros 98,5
4-Hydroxybenzaldehyde Acros 99
4-Methoxybenzaldehyde Merck 99
2,5-Dimethoxy benzaldehyde Acros 97
3,4,5- Trimethoxy benzaldehyde Acros 99
4-Dimetylaminobenzaldehyde Fisher 99 2-(Trifluoromethyl)-benzaldehyde Sigma-Aldrich 98 4-Benzyloxybenzaldehyde Acros 98 2-Nitrobenzaldehyde Acros 99 5-Iodovanillin Acros 97 4-Chlorobenzaldehyde Acros 98,5
Sodium metabisulfite Merck > 98
Sodium tetrahydroborate Fisher 98
Formaldehyde Fisher 37
Pyrrolidine Acros 99
Morpholine Fisher 99
1-Methylpiperazine Acros 99
Indole Acros 99
5-Bromoindole Acros 99
Indole-2-carboxylic acid Acros 99
2-Phenylindole Acros 99
Ethylene glycol Xilong > 99
Ethyl acetate Xilong 99,5
Ethanol Xilong 95 Chloroform Chemsol > 99 n-Hexane Xilong > 97 Methanol Xilong > 99,5 Acetone Xilong > 99,5 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị
Các dụng cụ và thiết bị được sử dụng trong quá trình tổng hợp hóa học được liệt kê trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Các dụng cụ và thiết bị sử dụng trong tổng hợp
Dụng cụ Thiết bị
Bình cầu một cổ cổ nhám Cân kỹ thuật
Bình cầu hai cổ cổ nhám Máy khuấy từ gia nhiệt IKA Ống nhỏ giọt Bộ lọc hút chân không Buchner
Becher, erlen Đèn soi UV 254 nm
Đũa thủy tinh Máy cô quay Buchi Rotavapor R 200
Pipet Tủ sấy chân không OV – 01
Ống sinh hàn Bơm chân không
Nhiệt kế
Cột chạy sắc ký Phễu lọc
2.2. Tổng hợp các dẫn xuất benzimidazole và indole
2.2.1. Tổng hợp các dẫn xuất của benzimidazole
Sơ đồ 2.1. Tổng hợp các dẫn xuất của benzimidazole
Bảng 2.3. Cấu trúc của các dẫn xuất benzimidazole tổng hợp
Số thứ tự Tên dẫn xuất* X Y Z R1 R2 R3 R4 1 12H H H - OH H H H 2 13H H H - H OH H H 3 14H H H - H H OH H 4 1MM H H - H H OCH3 H 5 1DM H H - OCH3 H H OCH3
6 1TM H H - H OCH3 OCH3 OCH3
7 1DA H H - H H N(CH3)2 H 8 12N H H - NO2 H H H 9 1TF H H - CF3 H H H 10 1IV H H - H OCH3 OH I 11 1BO H H - H H O-CH2-Ph H 12 1BA H H - H H H H 13 22H H CH3 - OH H H H 14 23H H CH3 - H OH H H
15 24H H CH3 - H H OH H
16 2MM H CH3 - H H OCH3 H
17 2DM H CH3 - OCH3 H H OCH3
18 2TM H CH3 - H OCH3 OCH3 OCH3
19 2DA H CH3 - H H N(CH3)2 H 20 22N H CH3 - NO2 H H H 21 2TF H CH3 - CF3 H H H 22 2IV H CH3 - H OCH3 OH I 23 2BO H CH3 - H H O-CH2-Ph H 24 32H H Cl - OH H H H 25 33H H Cl - H OH H H 26 34H H Cl - H H OH H 27 3MM H Cl - H H OCH3 H 28 3DM H Cl - OCH3 H H OCH3
29 3TM H Cl - H OCH3 OCH3 OCH3
30 3DA H Cl - H H N(CH3)2 H 31 32N H Cl - NO2 H H H 32 3TF H Cl - CF3 H H H 33 3IV H Cl - H OCH3 OH I 34 3BO H Cl - H H O-CH2-Ph H 35 42H Cl Cl - OH H H H 36 43H Cl Cl - H OH H H 37 44H Cl Cl - H H OH H 38 4MM Cl Cl - H H OCH3 H 39 4DM Cl Cl - OCH3 H H OCH3
40 4TM Cl Cl - H OCH3 OCH3 OCH3
41 4DA Cl Cl - H H N(CH3)2 H 42 42N Cl Cl - NO2 H H H 43 4TF Cl Cl - CF3 H H H 44 4IV Cl Cl - H OCH3 OH I 45 4BO Cl Cl - H H O-CH2-Ph H 46 52H H Ph-CO - OH H H H 47 53H H Ph-CO - H OH H H 48 54H H Ph-CO - H H OH H 49 5MM H Ph-CO - H H OCH3 H
50 5TM H Ph-CO - H OCH3 OCH3 OCH3
51 5DA H Ph-CO - H H N(CH3)2 H
52 52N H Ph-CO - NO2 H H H
53 5TF H Ph-CO - CF3 H H H
55 5BO H Ph-CO - H H O-CH2-Ph H
56 62H H - Ph- CH(OH) OH H H H
57 63H H - Ph- CH(OH) H OH H H
58 64H H - Ph- CH(OH) H H OH H
59 6MM H - Ph- CH(OH) H H OCH3 H
60 6TM H - Ph- CH(OH) H OCH3 OCH3 OCH3
61 6DA H - Ph- CH(OH) H H N(CH3)2 H
62 6TF H - Ph- CH(OH) CF3 H H H
63 6IV H - Ph- CH(OH) H OCH3 OH I
64 6BO H - Ph- CH(OH) H H O-CH2-Ph H
(*) Ký hiệu tên các dẫn xuất benzimidazole gồm hai phần số và chữ cái biểu thị cho hợp phần o- phenylenediamine và benzaldehyde tương ứng: phần số – biểu thị cho cấu trúc của o-phenylenediamine với độ phức tạp của nhóm thế tăng dần ở X và Y (1: X = Y = H; 2: X = H, Y = CH3; 3: X = H, Y = Cl; 4: X = Y = Cl; 5: X = H, Y = Ph-CO–; 6: X = H, Y = Ph- CH(OH)–); và phần chữ cái – biểu thị cho hợp phần benzaldehyde (2H, 3H và 4H: lần lượt chứa nhóm thế Hydroxyl ở vị trí 2, 3 và 4; MM, DM, TM: lần lượt chứa một, hai và ba nhóm thế Methoxy; DA: chứa nhóm DimethylAmin; 2N: chứa nhóm Nitro ở vị trí số 2; TF: chứa nhóm TriFlouro; IV: chứa Iodine và Vanillin; BO: chứa nhóm BenzylOxy; BA: BenzAldehyde)
Tổng hợp các dẫn xuất benzimidazole theo quy trình đã có [52], các dẫn xuất có số thứ tự từ 1 đến 55 (sơ đồ 2.1, bảng 2.3 và hình 2.1): lấy 2 mmol của các dẫn xuất o-phenylenediamine và 2 mmol của các dẫn xuất benzaldehyde cho vào bình cầu 2 cổ có chứa sẵn 15 mL hỗn hợp dung môi ethanol:nước (tỉ lệ 9:1 v/v). Sau đó cho thêm 2 mmol Na2S2O5 vào bình phản ứng. Hỗn hợp phản ứng được khuấy đều trong 2h. Sau phản ứng, hỗn hợp được mang đi lọc chân không và cô quay phần nước lọc được dưới áp suất thấp, thu được sản phẩm thô. Phần sản phẩm thô này được lần lượt đem rửa với nước và hexan (3 lần), sau đó sấy chân không ở 80 °C đến khối lượng không đổi. Quá trình kết tinh hoặc làm sạch bằng sắc kí cột được sử dụng và được nêu cụ thể ở phần xác định cấu trúc cho từng chất.
Hình 2.1. Quá trình tổng hợp các dẫn xuất benzimidazole, giai đoạn (1)
Tổng hợp các dẫn xuất benzimidazole có số thứ tự từ 56 đến 64 (sơ đồ 2.1, bảng 2.3 và hình 2.2.): lấy 1 mmol các dẫn xuất benzimidazole có số thứ tự từ 46 đến 51 và số thứ tự từ 53 đến 55 cho vào bình cầu 2 cổ, 5 mL methanol được thêm vào bình phản ứng. Hỗn hợp được khuấy đều cho đến khi thu được dung dịch đồng nhất, sau đó 2 mmol NaBH4 được thêm vào hỗn hợp phản ứng. Phản ứng được theo dõi bằng sắc kí bản mỏng, sử dụng hệ giải ly hexane:ethyl acetate (tỉ lệ 95:5 hoặc 9:1). Hỗn hợp sau phản ứng được cô quay dưới áp suất thấp để loại bỏ dung môi, thu được sản phẩm thô. Phần sản phẩm thô này được đem rửa nhiều lần với nước, sau đó sấy chân không đến khối lượng không đổi. Quá trình kết tinh hoặc làm sạch bằng sắc kí cột được sử dụng và được nêu cụ thể ở phần xác định cấu trúc cho từng chất.
Hình 2.2. Quá trình tổng hợp các dẫn xuất benzimidazole, giai đoạn (2) Cơ chế phản ứng ngưng tụ này được đề xuất như sau [117] (sơ đồ 2.2):
TS1 và TS2 là hai trạng thái chuyển đổi lưỡng cực được hình thành trong quá trình phản ứng. Sơ đồ 2.2. Cơ chế phản ứng đóng vòng benzimidazole
Giai đoạn 1: Đầu tiên Na2S2O5 phản ứng với nước tạo thành NaHSO3. Sau đó, aldehyde phản ứng cộng với NaHSO3 tạo thành bisulfite aldehyde. Đôi điện tử tự do của 1 nhóm NH2 trên dẫn xuất o-phenylenediamine tấn công vào nguyên tử carbon
của bisulfite aldehyde và loại bỏ 1 phân tử H2O hình thành dạng alkyl sulfonate. Alkyl sulfonate sẽ tiếp tục phản ứng với nhóm amine còn lại của phenylamine, dẫn đến sự hình thành hợp chất trung gian dihydroimidazole và tách muối NaHSO3. Giai đoạn 2: Quá trình vòng hóa và tách H2 tạo thành sản phẩm. Do cấu tạo không bền nên dihydroimidazole dễ tách hydro để tạo thành cấu trúc bền hơn. Trong giai đoạn này, việc đóng vòng benzimidazole được hoàn tất.
2.2.2. Tổng hợp các dẫn xuất indole dựa trên phản ứng Mannich đa hợp phần
Phản ứng tổng hợp các dẫn xuất indole được mô tả ở sơ đồ bên dưới:
Sơ đồ 2.3. Tổng hợp các dẫn xuất của indole
Bảng 2.4. Cấu trúc của các dẫn xuất indole tổng hợp
Hợp
chất* R R1
Amine
bậc hai R2 Dung môi
CPF H COOH H MeOH
CMF H COOH H MeOH
CIF H COOH H MeOH PPF H C6H5 H EG PMF H C6H5 H EG PAF H C6H5 H EG CPM H COOH 4-MeO-C6H4 EG CMM H COOH 4-MeO-C6H4 EG
CIM H COOH 4-MeO-C6H4 EG
PPM H C6H5 4-MeO-C6H4 EG
IPM H H 4-MeO-C6H4 EG
BPM Br H 4-MeO-C6H4 EG
BPC Br H 4-Cl-C6H4 EG
(*) Ký hiệu tên các dẫn xuất indole gồm ba chữ cái biểu thị lần lượt cho 3 hợp phần indole, amine và aldehyde: indole C: indole-2-Carboxylic acid; P: 2-Phenylindole; I: Indole; B: 5-Bromoindole
amine P: Pyrrolidine; M: Morpholine; I:pIperidine; A: 1-methylpiperAzine aldehyde F: Formaldehyde; M: 4-Methoxybenzaldehyde; C: 4-Chlorobenzaldehyde
Các dẫn xuất được tổng hợp trong môi trường EG được thực hiện theo quy trình của Rajesh và cộng sự [118] (sơ đồ 2.3, bảng 2.4 và hình 2.3): cho vào bình cầu hai cổ 3 mmol dẫn xuất aldehyde và 6 mmol dẫn xuất amine bậc hai, hỗn hợp được khuấy thành dạng đồng nhất. Sau đó cho từ từ vào hỗn hợp 3 mmol dẫn xuất indole trong 5 mL ethylene glycol (EG) ở 60 °C. Hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phòng từ 24h - 36h và được theo dõi bằng sắc ký bản mỏng. Sau khi phản ứng kết
thúc, tủa rắn được thu bằng cách lọc dưới áp suất thấp. Chất rắn được rửa với nước và hexane, sau đó sấy khô thu được sản phẩm. Các sản phẩm CPF, CMF, CAF, CIF sử dụng dung môi phản ứng là methanol.
Hình 2.3. Các bước tổng hợp các dẫn xuất 3-aminoalkylated indole
Cơ chế phản ứng này được đề xuất như sau [118] (sơ đồ 2.4): EG có xu hướng tạo liên kết hydro liên phân tử và nội phân tử bằng hai nhóm hydroxyl liền kề [119, 120], giúp các phân tử tác chất trong phản ứng có cơ hội tiến lại gần nhau hơn nhờ tạo liên kết hydro liên phân tử. Nguyên tử hydro của EG có tính acid đã hoạt hóa nguyên tử oxygen giàu điện tử trong nhóm carbonyl của aldehyde, để hình thành giai đoạn trung gian (i). Một nguyên tử oxygen của EG có tính base hơn nguyên tử oxygen còn lại tấn công vào proton hoạt động của phân tử amine vòng, cùng lúc đó đôi điện tử tự do trên nguyên tử N của amine vòng tấn công vào nguyên tử carbon tích điện dương của nhóm carbonyl để tạo thành trạng thái trung gian (i và ii). Ở giai đoạn (ii), nguyên tử oxygen của EG kích hoạt proton hoạt động, tách loại một phân tử nước cùng với EG để tạo thành ion iminium ở giai đoạn (iii), ion iminium này tấn công vào vị trí C-3 giàu điện tử của phân tử indole, theo sau đó là sự chuyển dời nguyên tử hydro trong phân tử indole để tạo thành sản phẩm 3-alkylamino-1H-indole.2.3. Các phương pháp phân lập, xác định tính chất vật lý và cấu trúc các dẫn xuất benzimidazole và indole
Sơ đồ 2.4. Cơ chế phản ứng Mannich tạo các dẫn xuất 3-aminoalkylated indole
2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng thực hiện trên bản silica gel tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại Mineralight ® Lamp ở hai bước sóng 254 và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%/EtOH, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu.
2.2.2. Rửa nhiều lần bằng dung môi
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc: chất phân cực sẽ tan trong dung môi phân cực và ngược lại. Tạp chất tan trong dung môi rửa mà không hòa tan chất cần phân lập, cần thiết phải lựa chọn dung môi phù hợp với độ phân cực và độ tan của chất trước khi tiến hành lọc rửa.
2.2.3. Kết tinh
Phương pháp kết tinh dựa trên sự khác nhau rõ rệt về độ tan của các chất trong một dung môi (hay hỗn hợp các dung môi) ở các nhiệt độ khác nhau, hoặc có sự khác nhau về độ tan giữa chất chính và tạp chất ở cùng một nhiệt độ. Dung môi hoặc hệ dung môi được lựa chọn để phù hợp kết tinh với từng chất.
2.2.4. Sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường 230-240 mesh (Merck) với hệ dung môi giải ly khác nhau phù hợp với từng chất.
2.2.4. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Dữ liệu sắc ký lỏng cao hiệu năng cao được bổ sung cho một hợp chất có hoạt tính sinh học tốt như 5MM, 53H, BPM, PPM, 3TF: sử dụng hệ máy HPLC Agilent 1200 (Agilent Technologies, CA, USA), đầu dò DAD ở bước sóng 254 nm, dữ liệu được ghi nhận bởi phần mềm Agilent Chemstation 4.0. Sử dụng cột C18 pha đảo Zorbax SB-C18 (Agilent Technologies, CA, USA) với thông số cột 4.6 mm×250 mm, kích thước hạt 5 μm. Thực hiện phân tích ở 26 °C, tốc độ dòng 0,8 mL/phút trong suốt quá trình chạy. Dung môi rửa giải A: nước cất chứa 0,1% formic acid và B: 100% acetonitrile. Điều kiện chạy như sau:
Thời gian (phút) Dung môi A (%) Dung môi B (%) 0 70 30 20 30 70 21 0 100 27 0 100
2.2.5. Đo điểm nóng chảy
Điểm nóng chảy được đo trên máy Electrothermal 9100 (UK), dùng mao quản, không hiệu chỉnh tại Viện Công nghệ Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.6. Phương pháp phổ hồng ngoại (FTIR)
Phổ hồng ngoại được đo trên máy FTIR Bruker Equinox 55, với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000- 400 cm-1, tại Viện Công nghệ Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.7. Phương pháp khối phổ phân giải cao (HRMS)
Khối phổ phân giải cao (dùng kĩ thuật ESI: electrospray ionization) được ghi trên hệ thống máy X500R QTOF (Sciex) tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Tp.HCM.
2.2.8. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được đo trên máy Bruker Advance AV500 MHz và Bruker DRX 500, tần số 500 MHz với phổ 1H-NMR và 125 MHz đối với phổ 13C-NMR, tại Viện Hóa Học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3. Phương pháp xác định hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các dẫn xuất
benzimidazole và indole
Ba dòng tế bào ung thư trên người sử dụng trong nghiên cứu: A549 (ung thư phổi), MDA-MB-231 (ung thư vú), PC3 (ung thư tuyến tiền liệt) được cung cấp bởi giáo sư Jeong-Hyung Lee – Khoa Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Kangwon – Hàn Quốc. Thử nghiệm ức chế tế bào ung thư được thực hiện tại Trung tâm tiên tiến về hóa sinh hữu cơ – Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Thử nghiệm gây độc dòng tế bào HEK 293 (tế bào thận gốc phôi ở người) – có nguồn gốc từ Ngân hàng Tế bào Hoa Kỳ ATCC – được thực hiện tại Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3.1. Nguyên tắc xác định
Các dẫn xuất tổng hợp benzimidazole và indole được đánh giá khả năng gây độc tế bào bằng phương pháp MTT (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) trên các dòng tế bào ung thư ở người: ung thư phổi A549, ung thư vú MDA-MB-231, ung thư tuyến tiền liệt PC3, sử dụng chứng dương là camptothecin. Nguyên lý của phép thử là vòng tetrazolium bám chặt vào ty thể của tế bào hoạt động, dưới tác dụng của enzyme succinate dehydrogenase (SDH) của ty thể chỉ có trong tế bào sống, MTT (màu vàng) biến đổi thành các tinh thể formazan (màu tím) (sơ đồ 2.5). Số lượng tế bào sống tỉ lệ thuận với nồng độ formazan, thể hiện qua giá trị mật độ quang OD của dung dịch đo ở 570 nm [121]. Độ hấp thụ được