(A) Sâu; (B) Hộp nhựa nuôi sâu; (C) Nhộng; (D) Hộp plastic để nuôi riêng nhộng và thành trùng; (E) thành trùng cái và đực
3.1.3.5. Điều chế mồi
a. Mồi là thành phần hóa học
Các hợp chất Z11-16:OH, Z11-16:Ald, Z11-16:OAc, AITC và Z3- 6:OAc được pha loãng trong n-hexane tinh khiết ở hàm lượng 10mg/ml. Dùng microsyringe hút lấy một lượng tương ứng bơm nhẹ lên thành bên trong của tuýp cao su non. Sau đó để yên 10 phút (cho dung môi bay hơi), tuýp cao su được gói lại bằng giấy nhôm, dán nhãn và trữ trong ngăn mát của tủ lạnh cho đến khi tiến hành thí nghiệm ngoài đồng (Hình 3.3).
b. Mồi là thành trùng
Thành trùng sâu tơ cái vũ hóa một ngày (chưa bắt cặp) được thả vào bên trong rổ lượt trà bằng lưới inox bên trong có treo một miếng bông gòn tẩm nước đường 10%. Rổ được đậy bằng một tấm bìa cứng và đặt vào giữa tấm dính của bẫy với phần mặt cầu của rỗ hướng lên trên (Hình 3.4.) Mồi chỉ được chuẩn bị vào buổi chiều ở thời điểm ngay trước khi treo bẫy trên ruộng thí nghiệm. Thành trùng trong bẫy và miếng bông gòn tẩm nước đường 10%, thành trùng trong bẫy được thay mới 3 - 4 ngày/lần vào lúc chiều mát (Reddy & Urs, 1997).
Hình 3.4. Sơ đồ điều chế mồi hấp dẫn đối với sâu tơ bằng thành trùng cái
c. Mồi là dịch nghiền cải
Lá cải bắp trưởng thành được rửa sạch, để ráo nước, cắt nhỏ, trộn đều. Trên ruộng thí nghiệm 50 g lá cải được cho vào cối sứ giả nhuyễn cùng với 5 ml n-hexane. Dùng ống nhỏ giọt hút 1,0 ml dịch lá cải nghiền cho vào mỗi miếng bông gòn được đặt trên miếng bìa cứng (1,5 cm x 2 cm) ở giữa tấm dính của bẫy (Hình 3.5). Mồi được thay mới 3 – 4 ngày/lần, cùng thời điểm với việc thay mới thành trùng cái trong bẫy (Đém & Vàng, 2014).
Hình 3.5. Sơ đồ điều chế mồi hấp dẫn đối với sâu tơ bằng dung dịch lá cải bắp
3.1.3.6. Đặt bẫy hấp dẫn trên ruộng thí nghiệm
Trên ruộng thí nghiệm, mồi được đặt lên giữa tấm dính và lồng vào mái che của bẫy. Dùng 2 thanh tre dài cắm chéo nhau trên mặt ruộng để treo bẫy ở độ cao cách mặt ruộng khoảng 0,5 m (Miluch et al., 2014) (Hình 3.6). Bẫy được đặt trên ruộng ở mật độ 12 bẫy/1.000 m2 (tương ứng khoảng 1 bẫy/80 m2) (Reddy & Urs, 1997).
Hình 3.6. Bẫy hấp dẫn được treo trên cải bắp thí nghiệm. Độ cao của bẫy (A);Khoảng cách giữa các bẫy (B) Khoảng cách giữa các bẫy (B)
3.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Đề tài ứng dụng hóa chất tín hiệu nhằm góp phần thay thế thuốc bảo vệ thực vật để quản lý sâu tơ P. xylostella hại rau cải ở điều kiện ngoài đồng.
Tổng hợp pheromone giới tính sâu tơ
1. Ảnh hưởng của thành phần pheromone giới tính tổng hợp
2. Ảnh hưởng của hàm lượng thành phần Z11-16:OH lên hiệu quả hấp dẫn
3. Ảnh hưởng của hàm lượng mồi lên hiệu quả hấp dẫn
Kairomone
(thương mại)
AITC
Đánh giá hiệu quả hấp dẫn phối hợp của pheromone giới tính và kairomone đối với sâu tơ 1.Khảo sát thời gian hoạt động của
thành trùng sâu tơ
2. Khảo sát sự biến động mật số quần thể sâu tơ trong năm
3. Khảo sát sự biến động mật số quần thể và tỷ lệ rau cải bị hại do sâu tơ trong một vụ cải
Đánh giá hiệu quả của biện pháp đặt bẫy hấp dẫn đối với sâu tơ
3.2.1.Tổng hợp pheromone giới tính của sâu tơ
Mục tiêu: Tổng hợp các thành phần pheromone giới tính sâu tơ để sử dụng làm nguồn vật liệu cho các nghiên cứu trong điều kiện ngoài đồng.
a) Quy trình tổng hợp
Các hợp chất Z11-16:OH, Z11-16:Ald và Z11-16:OAc tổng hợp bằng con đường sử dụng phản ứng Wittig chọn lọc (selective Wittig reaction) làm phản ứng chính (key reaction) đã được mô tả bởi Vang et al. (2008). Quy trình thực hiện được trình bày ở Hình 3.8.
Sau khi bảo vệ nhóm hydroxyl (OH) của hợp chất 11-Bromo-1- undecanol (1) bằng methoxymethyl (MOM) ether. Hợp chất Bromo ether (2)
sau đó được đun với Triphenylphosphine ở 1000C trong 24 giờ để thu được muối phosphonium (3). Muối (3) được chuyển sang hình thức ylide bằng cách khuấy với Sodium bis(trimethylsilyl)amide [NaN(SiMe3)2] trong dung môi THF, sau đó kết hợp với hợp chất Pentanal để tạo thành MOM ether của hợp chất Z11-16:OH (4). Sự bảo vệ nhóm chức của MOM ether được loại bỏ bằng cách khuấy (4) trong dung dịch 0,5N HCl trong methanol để thu được hợp chất Z11-16:OH. Oxy hóa và acetyl hóa hợp chất Z11-16:OH lần lượt bằng chất oxy hóa PCC và acetic anhydride [(CH3CO)2O)] thu được các hợp chất
Z11-16:Ald và Z11-16:OAc.
Br
BrPh3
d
Z11-16:OAc O
Hình 3.8. Sơ đồ biễu diễn quy trình tổng hợp các hợp chất Z11-16:OH, Z11-16:Aldvà Z11-16:OAc và Z11-16:OAc
a = DMM/LiBr/p-TsOH; b = PPh3/1000C; c = 1) NaN(SiMe3)2/THF, 2) pentanal/THF; d = 0.5N HCl/MeOH; e = PCC/CH2Cl2; f = acetic anhydride /pyridine
Điểm kết thúc ở mỗi phản ứng được xác định bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography, TLC).
Điểm chất chuẩn ban đầu 10 cm Điểm của chất phản ứng 2cm Hình 3.9. Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng
Phản ứng chỉ kết thúc khi trong mẫu không còn sự hiện diện của chất phản ứng ban đầu (không có đốm hiện diện của chất phản ứng ban đầu trên đường di chuyển theo dung môi của mẫu như ở Hình 3.10.
Hình 3.10. Các khoảng cách di chuyển của mẫu và dung môiHiệu suất phản ứng (HSPƯ) được tính theo công thức: Hiệu suất phản ứng (HSPƯ) được tính theo công thức:
Số mol của sản phẩm
HSPƯ (%) = --- x 100 Số mol của chất phản ứng
b) Thẩm định cấu trúc hóa học của mẫu tổng hợp
Mẫu tổng hợp ở mỗi giai đoạn của quy trình sau khi tinh lọc sẽ được thẩm định cấu trúc hóa học bằng kỹ thuật Sắc ký khí - Khối phổ (Gas chromatography - Mass spectrometry, GC - MS) và phương pháp phân tích phổ hồng ngoại (Infrared - IR) (tại khoa Khoa học, trường Đại học Cần Thơ). Đồng thời, mẫu cũng được gởi đến Phòng thí nghiệm Hóa chất sinh thái,
trường Đại học Nông nghiệp và Công nghệ Tokyo để phân tích Cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).
Hình 3.11. Hệ thống GC-MS dùng để đo phổi khối lượng của mẫu
3.2.2. Đánh giá hiệu quả hấp dẫn của pheromone tổng hợp đối với sâu tơ 3.2.2.1. Ảnh hưởng của thành phần pheromone giới tính tổng hợp đối với sâu tơ
- Mục tiêu: xác định ảnh hưởng của thành phần điều chế lên hiệu quả hấp dẫn của mồi pheromone giới tính đối với sâu tơ.
- Sự đánh giá được tiến hành ở hai địa điểm gồm:
+ Địa điểm 1 được thực hiện tại ruộng cải bắp, thời điểm 60 ngày sau
khi trồng, có diện tích 4.000 m2 tại xã Thành Lợi, huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long tiến hành từ ngày 17/7/2016 đến 14/8/2016.
+ Địa điểm 2 được thực hiện tại ruộng cải bắp ở thời điểm 50 ngày sau
khi trồng, có diện tích 2.500 m2 tại xã Tham Đôn, huyện Mỹ Xuyên, tỉnh Sóc Trăng tiến hành từ ngày 9/9/2016 đến 11/10/2016.
- Cách tiến hành: thí nghiệm được bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố với 9 nghiệm thức và 3 lần lặp lại (Bảng 3.1). Mỗi lần lặp lại của một nghiệm thức tương ứng với một bẫy. Trong đó, có 7 nghiệm thức chứa ba hợp chất Z11-16:Ald, Z11-16:OAc và Z11-16:OH riêng lẻ hoặc kết hợp. Nghiệm thức với mồi là 01 thành trùng cái chưa bắt cặp làm đối chứng dương và một nghiệm thức với mồi là tuýp cao su chỉ nhồi 5µl n- hexane làm đối chứng âm.
- Chỉ tiêu ghi nhận: ghi nhận số lượng thành trùng sâu tơ đực vào bẫy 1 tuần/lần, chỉ tiêu theo dõi trong 4 tuần.
Bảng 3.1. Các nghiệm thức bố trí trong thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của thành phần pheromone giới tính đối với sâu tơ
Nghiệm thức A-1 A-2 A-3 A-4 A-5 A-6 A-7 A-8 A-9
Ghi chú: *Thành trùng cái chưa bắt cặp được thay 3 - 4 ngày/lần
3.2.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng thành phần Z11-16:OH lên hiệu quả hấp dẫn của mồi pheromone giới tính tổng hợp đối với sâu tơ
Kế thừa kết quả từ Mục 3.2.4.1 chọn mồi gồm hai thành phần Z11- 16:Ald và Z11-16:OAc (tỷ lệ 1:1) để tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thành phần Z11-16:OH lên hiệu quả hấp dẫn của mồi pheromone giới tính.
- Mục tiêu: xác định tỷ lệ phối trộn của hợp chất Z11-16:OH lên hiệu quả hấp dẫn của mồi pheromone giới tính đối với sâu tơ.
- Thời gian: thí nghiệm được tiến hành từ ngày 30/02/2017 đến 27/03/2017.
- Địa điểm: thí nghiệm được thực hiện trên ruộng cải bắp có diện tích 1.500 m2 tại xã Tham Đôn, huyện Mỹ Xuyên, tỉnh Sóc Trăng.
- Cách tiến hành: thí nghiệm bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố với 5 nghiệm thức và 3 lần lặp lại (Bảng 3.2). Mỗi lần lặp lại của một nghiệm thức tương ứng với một bẫy. Trong đó, 3 nghiệm thức được phối với nồng độ thay đổi của Z11-16:OH. Nghiệm thức với mồi là 01 thành trùng cái chưa bắt cặp làm đối chứng dương và một nghiệm thức với mồi là tuýp cao su chỉ nhồi 5 µl n-hexane làm đối chứng âm.
- Chỉ tiêu ghi nhận: ghi nhận số lượng thành trùng sâu tơ đực vào bẫy 1 tuần/lần, chỉ tiêu theo dõi trong 4 tuần.
Bảng 3.2. Các nghiệm thức bố trí trong thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của Z11- 16:OH lên hiệu quả hấp dẫn mồi pheromone giới tính tổng hợp đối với sâu tơ
Nghiệm thức B-1 B-2 B-3 B-4 B-5
Ghi chú: *Thành trùng cái chưa bắt cặp được thay 3 - 4 ngày/lần
3.2.2.3. Ảnh hưởng của hàm lượng mồi lên hiệu quả hấp dẫn của mồi pheromone giới tính tổng hợp Z11-16:Ald, Z11-16:OAc và Z11-16:OH đối với sâu tơ
Kế thừa kết quả Mục 3.2.4.2 tiến hành tiếp thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng mồi lên hiệu quả hấp dẫn của mồi pheromone giới tính.
- Mục tiêu: xác định hàm lượng mồi pheromone giới tính cho hiệu quả hấp dẫn cao đối với thành trùng sâu tơ.
- Thời gian: thí nghiệm được tiến hành từ ngày 03/4/2017 đến 31/4/2017.
- Địa điểm: thí nghiệm được thực hiện trên ruộng cải bắp có diện tích 3.200 m2 tại xã Tham Đôn, huyện Mỹ Xuyên, tỉnh Sóc Trăng.
- Cách tiến hành: thí nghiệm bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố với 9 nghiệm thức và 3 lần lặp lại (Bảng 3.3). Mỗi lần lặp lại tương ứng với một bẫy. Trong đó, 7 nghiệm thức là dãy hàm lượng từ 0,01 – 1,0 mg/tuýp cao su của hỗn hợp ba hợp chất Z11-16:Ald, Z11-16:OAc và
Z11-16:OH ở tỷ lệ phối trộn 5:5:1, tương ứng. Nghiệm thức với mồi là 01 thành trùng cái chưa bắt cặp làm đối chứng dương và một nghiệm thức với mồi là tuýp cao su chỉ nhồi 5µl n-hexane làm đối chứng âm.
- Chỉ tiêu ghi nhận: ghi nhận số lượng thành trùng sâu tơ đực vào bẫy 1 tuần/lần, chỉ tiêu theo dõi trong 4 tuần.
Bảng 3.3. Các nghiệm thức bố trí trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng hàm lượng của mồi pheromone lên hiệu quả hấp dẫn đối với sâu tơ
Nghiệm thức C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C-7 C-8 C-9
Ghi chú: *Thành trùng cái chưa bắt cặp thay 3 - 4 ngày/lần
3.2.3. Đánh giá hiệu quả hấp dẫn của kairomone đối với sâu tơ
3.2.3.1. Đánh giá hiệu quả của hợp chất Allyl isothiocyanate (AITC) đối với sâu tơ
- Mục tiêu: xác định khả năng hấp dẫn của hợp chất AITC đối với thành trùng sâu tơ.
- Thời gian: thí nghiệm được tiến hành từ ngày 10/9/2016 đến 8/10/2016.
- Địa điểm: thí nghiệm được thực hiện trên ruộng cải bắp, có diện tích 2.400m2 tại xã Tham Đôn, huyện Mỹ Xuyên, tỉnh Sóc Trăng.
- Cách tiến hành: thí nghiệm bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố với 7 nghiệm thức và 3 lần lặp lại (Bảng 3.4). Mỗi lần lặp lại của một nghiệm thức tương ứng với một bẫy. Trong đó, 5 nghiệm thức là các hàm lượng 0,1; 0,3; 0,5; 0,7 và 1 mg/tuýp của hợp chất AITC. Nghiệm thức với mồi là 1,0 ml dịch lá cải nghiền làm đối chứng dương và một nghiệm thức với mồi là tuýp cao su chỉ nhồi 5µl n-hexane làm đối chứng âm.
- Chỉ tiêu ghi nhận: ghi nhận số lượng thành trùng sâu tơ đực và cái vào bẫy 1 tuần/lần, chỉ tiêu theo dõi trong 4 tuần.
Bảng 3.4. Các nghiệm thức bố trí trong thí nghiệm đánh giá hiệu quả hấp dẫn của hợp chất AITC đối với thành trùng sâu tơ
Nghiệm thức D-1 D-2 D-3 D-4 D-5 D-6 D-7
Ghi chú: *Dịch lá cải nghiền được thay 3 - 4 ngày/lần
3.2.3.2. Đánh giá hiệu quả của hợp chất cis -3-hexenyl acetate (Z3-6:OAc) đối với sâu tơ
- Mục tiêu: xác định khả năng hấp dẫn của hợp chất Z3-6:OAc đối với thành trùng sâu tơ.
- Thời gian: thí nghiệm được tiến hành từ ngày 23/8/2016 đến 21/9/2016.
- Địa điểm: thí nghiệm được thực hiện trên ruộng cải bắp, có diện tích 2.500 m2 tại xã Tham Đôn, huyện Mỹ Xuyên, tỉnh Sóc Trăng.
- Cách tiến hành: thí nghiệm bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố với 7 nghiệm thức và 3 lần lặp lại (Bảng 3.5). Mỗi lần lặp lại của một nghiệm thức tương ứng với một bẫy. Trong đó, 5 nghiệm thức là các hàm lượng 0,01; 0,05; 0,1; 0,5 và 1,0 mg/tuýp của hợp chất Z3-6:OAc. Nghiệm thức với mồi là 1,0 ml dịch lá cải nghiền làm đối chứng dương và một nghiệm thức với mồi là tuýp cao su chỉ nhồi 5µl n-hexane làm đối chứng âm.
- Chỉ tiêu ghi nhận: ghi nhận số lượng thành trùng sâu tơ đực và cái vào bẫy 1 tuần/lần, chỉ tiêu theo dõi trong 4 tuần.
Bảng 3.5. Các nghiệm thức bố trí trong thí nghiệm đánh giá hiệu quả hấp dẫn của hợp chất Z3-6:OAc đối với thành trùng sâu tơ
Nghiệm thức E-1 E-2 E-3 E-4 E-5 E-6 E-7
Ghi chú: *Dịch lá cải nghiền được thay 3 - 4 ngày/lần
3.2.4. Đánh giá hiệu quả hấp dẫn phối hợp của pheromone giới tính và kairomone đối với sâu tơ
Kế thừa kết quả Mục 3.2.4.3, 3.2.5.1 và 3.2.5.2 tiến hành thí nghiệm đánh giá hiệu quả hấp dẫn phối hợp của pheromone và các hợp chất AITC và
Z3-6:OAc đối với sâu tơ.
- Mục tiêu: xác định hiệu quả phối hợp của pheromone giới tính và các hợp chất hữu cơ bay hơi trong hấp dẫn thành trùng sâu tơ.
- Thời gian: thí nghiệm được tiến hành từ ngày 30/5/2017 đến 27/6/2017.
- Địa điểm: thí nghiệm được thực hiện trên ruộng cải bắp, có diện tích 2.400 m2 tại xã Tham Đôn, huyện Mỹ Xuyên, tỉnh Sóc Trăng.
- Cách tiến hành: thí nghiệm được bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố với 9 nghiệm thức và 3 lần lặp lại (Bảng 3.6). Mỗi lần lặp lại của một nghiệm thức tương ứng với một bẫy. Trong đó, 7 nghiệm thức chứa 3 hợp chất pheromone giới tính tổng hợp, AITC, Z3-6:OAc riêng lẻ hoặc kết hợp. Nghiệm thức với mồi là 01 thành trùng cái chưa bắt cặp làm đối chứng dương và một nghiệm thức với mồi là tuýp cao su chỉ nhồi 5µl n- hexane làm đối chứng âm.
- Chỉ tiêu ghi nhận: ghi nhận số lượng thành trùng sâu tơ đực và cái vào bẫy 1 tuần/lần, chỉ tiêu theo dõi trong 4 tuần.
Bảng 3.6. Các nghiệm thức bố trí trong thí nghiệm đánh giá hiệu quả hấp dẫn phối hợp của pheromone giới tính và các hợp chất AITC, Z3-6:OAc đối với thành trùng sâu tơ Nghiệm thức F-1 F-2 F-3 F-4 F-5 F-6 F-7