4. Nội dung nghiên cứu
1.3.1. Trên thế giới
Haematococcus được Girod – Chantrans thực hiện nghiên cứu đầu tiên vào năm 1797 và liên tục được các nhà khoa học như Jian Li, Miguel Olaizola, Norihiko Hata, Agardh, Cohn, Braun, Rostafinski, Butschli và nhiều nhà khoa học ở trên thế giới tiếp tục nghiên cứu cho đến nay. Từ những thập kỷ cuối của thế kỷ XIX, người ta đã tìm ra các đặc điểm sinh học của loài vi tảo này.
Từ năm 1993, Kobayashi đã nghiên cứu ảnh hưởng của Natri acetate và sắt ảnh hưởng đến sự tích lũy astaxanthin của vi tảo H. lacustris, kết quả cho thấy tế bào vi tảo đã hình thành bào nang khi nuôi cấy trong môi trường bổ sung cả Natri acetate và sắt nhanh hơn so với môi trường chỉ bổ sung Natri acetate. Năm 1996, Harker đã thực hiện nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tổng hợp astaxanthin của vi tảo H. lacustris. Khi vi tảo được nuôi cấy trong điều kiện môi trường thiếu hụt nitrat, nồng độ sắt tăng, nồng độ muối cao thì sự sinh trưởng và phát triển của vi tảo khá hạn chế và hàm lượng astaxanthin được kích thích tổng hợp rất nhiều [18]. Gong và Chen (1998) đã thực hiện nghiên cứu ảnh hưởng của các thành phần môi trường đến hàm lượng tích lũy astaxanthin, phương pháp phản ứng bề mặt được sử dụng để kiểm tra ảnh hưởng của năm thành phần môi trường chính. Nồng độ dinh dưỡng tối ưu cho hàm lượng astaxanthin (mg/g tế bào khô) là 1,64 g/L natri acetate 0,03 g/L kali nitrat, 40 ml/L của dung dịch gốc nguyên tố chính và 0.14 ml/L của dung dịch gốc nguyên tố vi lượng [14].
Năm 1999 nhà khoa học Tripathi đã thực hiên nghiên cứu nuôi cấy
Haematococcus lacustris trên các môi trường khác nhau có bổ sung thêm Vitamin B vào môi trường nuôi. Nghiên cứu này đã cho kết quả khả thi để nuôi cấy vi tảo đạt mật độ tối ưu để thuận tiện cho việc tích lũy astaxanthin [57]. Việc phát triển hệ thống nuôi photobiorector đã được nghiên cứu bởi Olaizola, hệ thống 25000 L đã cho kết quả khả thi cho việc nuôi cấy và tích lũy astaxanthin của vi tảo Haematococcus lacustris. Năm 2001, nghiên cứu về hệ thống nuôi 2 pha trên tảo Haematococcus lacustris với mục đích nâng cao sinh khối và hàm lượng astaxanthin cao hơn so với những nghiên cứu trước đây. Đồng thời, Hata đã phát triển hệ thống nuôi cấy quang tự dưỡng liên tục hoàn toàn tự động cho hiệu quả cao về năng suất tổng hợp astaxanthin [19].
Song song với các nghiên cứu phát triển hệ thống nuôi cấy thì việc tối ưu hóa môi trường nuôi cấy vẫn liên tục được nghiên cứu. Fábregas (2003) đã nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng dinh dưỡng và cường độ chiếu sáng đến sự sản sinh astaxanthin của vi tảo. Kết quả cho rằng dinh dưỡng là yếu tố chính để quyết định sự tổng hợp astaxanthin, khi nuôi trong điều kiện ánh sáng yếu đầy đủ dinh dưỡng cho hàm lượng astaxanthin thấp hơn so với ánh sáng cao. Ở mức dinh dưỡng cao thúc đẩy quá trình bằng cách tăng tốc độ sử dụng dinh dưỡng và cũng cấp nhiều năng lượng hơn cho quá trình tổng hợp astaxanthin [12]. Katsuda (2004) đã nghiên cứu ảnh hưởng của đèn LED ở những phổ ánh sáng khác nhau đến sự tích lũy astaxanthin, kết quả nghiên cứu cho cho rằng ở đèn LED bước sóng ngắn (380 nm đến 470 nm) đã được chứng minh để gây ra sự tích lũy astaxanthin lên đến 5 – 6% TLK [24]. Năm 2006, Kim đã thực hiện nghiên cứu tích lũy astaxanthin trong điều kiện đèn nhấp nháy thay cho ánh sáng liên tục kết quả đã cho năng suất tích lũy cao hơn gấp nhiều lần [25].
Để phát triển được ở quy mô công nghiệp đòi hỏi chúng ta phải nghiên cứu những mô hình nuôi thực tế có tính khả thi hơn. Carmen Garcia (2008) nghiên cứu hệ thống nuôi ngoài trời, khi kết hợp với Natri acetate đã cho kết quả khả thi hơn, giảm lượng vi sinh vật xâm nhập vào và tích lũy astaxanthin được cải thiện. Điều này mở ra hướng nghiên cứu mới để phát triển trên quy mô công nghiệp. Cùng với đó Ranjbar nghiên cứu hệ thống nuôi trong cột kết hợp với Natri acetate để tăng nhanh sinh khối tảo sau đó môi trường dinh dưỡng bị cắt giảm đồng thời kết hợp với cường độ ánh sáng cao đã cho sự tích lũy astaxanthin cao đạt 390 mg/L (Ranjbar và cs, 2008). Nghiên cứu nuôi cấy H. lacustris liên tục cho việc sản xuất thương mại, khi tác dụng của CO2 được nghiên cứu trong môi trường nuôi cấy cơ bản, ảnh hưởng của khử trùng cũng được nghiên cứu trong môi trường nuôi cấy của Rudic trong các máy phát quang loại bảng dọc trong 31 ngày canh tác bán liên tục. Mật độ tế bào tối đa 10,55.105tb/ml , tương ứng với tốc độ tăng trưởng 0,271 ngày 1 với năng suất diện tích 3,531 g/m2/ngày đã được tìm thấy trong môi trường RM không tiệt trùng vào ngày thứ 24 của đợt thứ ba canh tác bán liên tục với tỷ lệ đổi mới 50% trong một máy phát quang loại bảng dọc (Imamoglu và cs, 2010). Theo nghiên cứu của Solovchenko và cs (2011) khi vi tảo được chiếu sáng dưới cường độ ánh sáng cao vi tảo có khả năng chống chịu và hình thành sự tích lũy astaxanthin. Sự tích lũy astaxanthin trong quá trình thích nghi ánh sáng cao đi kèm với sự tăng dần tỉ lệ mật độ quang phổ OD480/OD678[53]. Li (2011) đã thử nghiệm nuôi trồng H. lacustris trên quy mô lớn kết quả đạt được 900 kg/năm tảo thu dược đem về một chi phí lợi nhuận rất cao [31]. Một hệ thống biofilm đang được nghiên cứu và phát triển, hệ thống này sử dụng màng sinh học để vi tảo bám vào đó giữa môi trường và màng sinh học là một vật liệu có thể thẩm thấu được môi trường và môi trường được bơm tuần hoàn liên tục. Hệ thống này đem lại những kết quả đáng chú ý bởi nó có thể hạn
chế được sự xâm nhiễm vi khuẩn và nhiễm chéo các loài tảo khác[39]. Xi và cs (2016) thực hiện việc tăng cường sản xuất astaxanthin bằng H. lacustris
mới.Trong nghiên cứu này họ dụng đèn LED màu đỏ cho sự tăng trưởng tế bào vi tảo và sau đó chuyển sang đèn LED màu xanh để tạo ra astaxanthin sinh tổng hợp [60]. Kết quả cho thấy các sản phẩm astaxanthin dựa trên sự thay đổi bước sóng từ màu đỏ sang màu xanh đã tăng đáng kể, so với những sản phẩm chiếu sáng liên tục sử dụng đèn LED màu đỏ. Hơn nữa, tăng thêm sản xuất astaxanthin đã đạt được với ứng dụng đồng thời của carbon ngoại sinh với ánh sáng LED màu xanh. Cách tiếp cận của chúng tôi dựa trên sự vận động đúng đắn của các bước sóng LED khi H. pluvialis giai đoạn tế bào sẽ giúp cải thiện sinh khối và tăng cường sản xuất astaxanthin sử dụng H. pluvialis. Những năm gần đây, các nhà khoa học đã nghiên cứu phát triển những hệ thống nuôi hiện đại Christian và cs (2018), đã nghiên cứu tăng cường tích lũy astaxanthin trong H. lacustris bằng cách kết hợp giữa chiếu sáng cao và nồng độ carbon dioxide tăng cao (5 hoặc 15%). Sự ra đời của CO2 thay đổi cân bằng C/N tạo ra sự thiếu hụt chất dinh dưỡng mà không thay đổi môi trường. Sản lượng astaxanthin thu được gấp 2 gấp 3 lần so với chỉ sử dụng một trong hai yếu tố gây căng thẳng. Kết quả năm 2019, hệ thống nuôi tích lũy vi mô được nghiên cứu kết quả kích thước tế bào to hơn so với bình thường và hàm lượng astaxanthin đạt được khá ổn định (Han và cs, 2019). Khi nuôi kết hợp với FeSO4+ NaCl+ NaHCO3 thì sự tích lũy astaxanthin diễn ra nhanh hơn từ 7 ngày giảm xuống còn 4 ngày so với lô đối chứng điều này đã cung cấp một tín hiệu tốt cho việc phát triển nền công nghiệp nuôi cấy tảo [29]. Công bố này cung cấp thêm dữ liệu để phát triển việc sản xuất tảo ở quy mô lớn [59].
Vi tảo Haematococcus lacustris đã được nghiên cứu và phát triển ở nhiều quốc gia trên thế giới bao gồm Ấn Độ, Hoa Kỳ, Nhật Bản,… nhiều
quốc gia đã và đang phát triển trên quy mô công nghiệp hiện đại. Chứng tỏ tiềm năng việc phát triển đối với loài tảo này rất lớn. Việc nghiên cứu và phát triển chúng là rất cần thiết để cung cấp những dẫn liệu khoa học cần thiết để có thể tối ưu được sự sản xuất quy mô lớn hơn.
1.3.2. Ở Việt Nam
Việt Nam là một nước nhiệt đới, có khí hậu nóng ẩm rất thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật, đặc biệt là vi tảo. Từ năm 1972, các nhà khoa học đã bắt đầu nghiên cứu tảo, đứng đầu ngành là cố GS.TSKH Nguyễn Hữu Phước.
Năm 1976, việc thử nghiệm nuôi trồng tảo đã được tiến hành trong 4 – 5 tháng ở Nghĩa Đô, Hà Nội và thu được kết quả khá khả quan. Năm 1985, Sở Y Tế thành phố Hồ Chí Minh đã được tiếp nhận giống tảo đầu tiên do ông bà Fox tặng. Sau đó, tảo giống được giao cho trạm nghiên cứu dược liệu giữ giống và nuôi trồng [10]. Tiếp theo những năm sau đó những nghiên cứu tối ưu môi trường sống và về hình thái tế bào, hàm lượng sắc tố và protein nội bào trong vòng đời của vi tảo được nghiên cứu sâu hơn. Đặng Diễm Hồng và cs (2012) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nitrat kết hợp với điều kiện chiếu sáng đến sự sinh trưởng của vi tảo H. lacustris, kết quả mật độ tế bào tăng 25% khi nuôi cấy ở nồng độ nitrat từ 399 – 1200 mg/L trong môi trường RM và mật độ đạt tối đa ở 22 ngày nuôi khi được chiếu sáng 16:8 (sáng:tối) thời gian chiếu sáng bằng đèn huỳnh quang là 10 giờ và đèn UV 6 giờ đạt 3,2.106 tb/ml [21]. Hoàng Thị Thụ Thụ (2013) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nitrat đến sự sinh trưởng của vi tảo, vi tảo đạt được mật độ cao nhất 1,76.106 tb/ml trong môi trường chứa 876 mg/L nitrat [20]. Năm 2017, Trịnh Ngọc Nam đã nghiên cứu điều kiện tích lũy astanxanthin bằng sự kết hợp của cường độ ánh sáng cao và nồng độ CO2 cao [2]. Đặng Phú Hoàng và cs
(2017) đã nghiên cứu điều kiện sinh trưởng và tích lũy astaxanthin. Trong nghiên cứu này kết quả nuôi thử nghiệm trên môi trường C cho mật độ sinh trưởng cao nhất đạt 27,89.104 tb/ml và bổ sung thêm 699 mg/L NaNO3 và môi trường C nâng mật độ đạt 34,85.104 tb/ml. Khi sử dụng nồng độ NaCl từ 1 – 2% cường độ ánh sáng mạnh và salicylic acid đã kích thích H. lacustris tổng hợp astaxanthin [1].
Nhìn chung, lịch sử nghiên cứu và nuôi trồng tảo ở nước ta đã có từ lâu và thu được nhiều kết quả ban đầu đáng khích lệ. Nhưng cho đến nay chưa có nhiều nghiên cứu cảm ứng tích lũy astaxanthin. Hiện nay, việc nuôi trồng đa số vẫn còn gặp nhiều khó khăn, vì Haematococcus lacustris có tốc độ sinh trưởng thấp, chu kỳ sống phức tạp và nhạy cảm với sự thay đổi của điều kiện nuôi cấy. Nên chưa đáp ứng được nhu cầu trong nước và xuất khẩu nước ngoài [11]. Do Thanh Tri đã nghiên cứu năng suất sinh khối và astaxanthin của H. lacustris trong hệ thống nuôi rắn. Nuôi trồng trên bề mặt xốp có hai lớp: lớp xốp và lớp màng, đây là một hệ thống có tiềm năng rất lớn có thể thay thế cách nuôi truyền thống. Bởi vì nó mang nhiều ưu điểm có thể giúp hạn chế nhiễm vi khuẩn khác trong quá trình nuôi [10].
CHƯƠNG 2.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
Chủng tảo lục Haematococcus lacustris được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Tảo khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm – ĐHĐN. Haematococcus lacustris được nuôi cấy trong môi trường BBM, chế độ chiếu sáng 16:8 với cường độ 35 µmol.m-2.s-1 nhiệt độ 25 ± 20C.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Bố trí thí nghiệm
a. Thí nghiệm 1: Thí nghiệm tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)
- Mục tiêu thí nghiệm: Tìm ra môi trường dinh dưỡng tối ưu bằng cách tối ưu hóa được các yếu tố đa lượng trong môi trường BBM (N, P) dùng để nuôi vi tảo H. lacustris.
- Mô tả thí nghiệm: Thí nghiệm tối ưu hoá được thiết kế thử nghiệm dựa trên cấu trúc của mô hình bố trí thí nghiệm trung tâm (CCD-Central composite design) đối với 2 yếu tố dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy BBM: Hàm lượng Nitơ và Photpho được gọi là các biến độc lập. Các điểm trung tâm và bước nhảy của mỗi yếu tố được xác định lần lượt là N = 0,8 ± 0,4 và P = 0,04 ± 0,02 dựa trên các thí nghiệm sàng lọc và nghiên cứu tài liệu. Biến đáp ứng được chọn là tốc độ sinh trưởng.
Mô hình dự đoán được biểu diễn bằng phương trình bậc 2 đầy đủ: Y = β + β1x1 + β2x2 + β12x1x2 + β11x21 + β22x2
Trong đó, Y là tốc độ tăng trưởng (d); x1, x2 lần lượt là Nitơ và Photpho; β1, β2 là các hệ số bậc 1 tương ứng; β12 là hệ số tương tác của cặp yếu tố tương ứng; β11, β22 là các hệ số bậc 2 tương ứng.
- Thông số theo dõi: Mật độ tế bào vi tảo H. lacustris.
b. Thí nghiệm 2: Thí nghiệm ảnh hưởng của sự thiếu hụt dinh dưỡng tới khả năng tổng hợp astaxanthin ở vi tảo H. lacustris trong mô hình nuôi hai pha.
Mục tiêu thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của sự thiếu hụt dinh dưỡng tới khả năng kích ứng tổng hợp astaxanthin ở vi tảo H. lacustris trong mô hình nuôi hai pha.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức với 3 lần lặp lại. NT1: môi trường không có Nitrat (0N), NT2: môi trường không có Nitrat Phosphat (0N0P), NT3: môi trường không chứa Phosphat (0P), NT4: môi trường BBM, NT5: môi trường chứa ½ nitrat (1/2N).
Mô tả thí nghiệm: Vi tảo H. lacustris được nuôi trong môi trường BBM ở điều kiện chiếu sáng 35 µmol.m-2.s-1 và 250C đến khi tế bào H. lacustris ở trạng thái sinh dưỡng (80 – 90% tổng số tế bào) sẽ được chuyển sang các NT1, NT2, NT3, NT4, NT5 kết hợp với ánh sáng trắng ở cường độ ánh sáng 100 µmol.m-2.s-1.
c. Thí nghiệm 3: Thí nghiệm ảnh hưởng của phổ ánh sáng đến vi tảo H. lacustris trong pha tích lũy astaxanthin.
Mục tiêu thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của cường độ và các phổ ánh sáng đến sự tích lũy astaxanthin của H. lacustris.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức với 3 lần lặp lại. NT1: Ánh sáng trắng, NT2: Ánh sáng xanh, NT 3: Ánh sáng đỏ
Mô tả thí nghiệm: Vi tảo H. lacustris được nuôi trong môi trường BBM ở điều kiện chiếu sáng 35 µmol.m-2.s-1 và 250C đến khi tế bào H. lacustris ở
trạng thái sinh dưỡng (80 – 90% tổng số tế bào) sẽ được chuyển sang các NT1, NT2, NT3 ở cường độ 100 µmol.m-2.s-1.
d. Thí nghiệm 4: Thí nghiệm ảnh hưởng của axetat và sắt đến vi tảo H. lacustris trong pha tích lũy astaxanthin.
Mục tiêu thí nghiệm: Đánh giá khả năng sử dụng acetat và sắt để kích ứng tích lũy astaxanthin ở vi tảo H. lacustris.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức với 3 lần lặp lại. NT1 (DC): Nước cất, NT2 (Ac): Nước cất có bổ sung acetat 30mM, NT3: (axetat+Fe2+): Nước cất có bổ sung axetat 30mM + Fe2+ 300uM, NT4 (Fe): Nước cất có bổ sung Fe2+ 300uM
Mô tả thí nghiệm: Vi tảo H. lacustris được nuôi trong môi trường BBM ở điều kiện chiếu sáng 35 µmol.m-2.s-1 và 250C đến khi tế bào H. lacustris ở trạng thái sinh dưỡng (80 – 90% tổng số tế bào) sẽ được chuyển sang các NT1, NT2, NT3, NT4. Thí nghiệm được tiến hành dưới điều kiện cường độ ánh sáng trắng đèn LED 7000 lux, chế độ chiếu sáng liên tục. Mật độ (tb/ml) và đường kính tế bào (μm) được theo dõi sau 2h, 24h và 54h tính từ lúc bắt đầu thí nghiệm.
2.2.3. Phương pháp xác định khối lượng
Sự phát triển của tế bào được theo dõi bằng cách đo độ hấp thụ khác nhau ở hai bước sóng 680 nm và 750 nm với máy quang phổ UV/VIS (UV- 2802PC UNIC), khối lượng của tế bào được tính theo công thức:
Khối lượng = [-4.2 × {(OD680 - OD750)/OD680} + 1.4] × OD680
Tốc độ sinh trưởng của vi tảo H. lacustris được tính dựa trên kết quả khối lượng tế bào thu được ở các nghiệm thức thí nghiệm. Tốc độ sinh trưởng được tính theo công thức của Han Shun và cộng sự (2016):