1.3.1. Nguồn phân lập vi khuẩn biển sinh alginate lyase
Các chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh alginate lyase chủ yếu được phân lập từ cầu gai, san hô mềm, rong biển và những loài động vật hai mảnh. Sở dĩ được tìm kiếm ở những vật chủ như vậy vì đây là những loài sử dụng rong tảo làm thức ăn, hệ vi sinh vật đường ruột những loài này luôn có một hoặc một hệ vi khuẩn sinh alginate lyase để hỗ trợ chuyển hóa thức ăn. Ngoài ra, nước biển và hải miên cũng là nguồn để phân lập vi sinh vật sản sinh alginate lyase [6]. Các chủng vi khuẩn phổ biến sinh alginate lyase như:
Sphingomonas sp., Flavobacterium sp., Saccharophagus sp., Vibrio sp., Pseudomonas sp.,….(được trình bày ở Bảng 1.2).
Bảng 1.2. Nguồn phân lập một số vi khuẩn biển sinh alginate lyase
STT Vi khuẩn biển Nguồn phân lập
Nguồn tài liệu tham
khảo
1 Alginovibrio aquatilis Từ nước biển, đất [59]
2 Alteromonas sp. (chủng H-4)
Từ phân hủy tảo biển Lamina japonia, [60] [61] 3 Tamlanap sp. Hải sâm Apostichopus japonicus [62]
4 Pseudoalteromonascarrageenovora ASY5 Từ đất ngập mặn [63] 5 Vibrio furnissii H1 Rong biển thối rửa [64] 6 Pseudomonas alginovora Tảo nâu Laminaria [56], [65]
7 Vibrio sp. Tảo nâu [66]
8 Vibrio harveyi AL-128 Nước biển [67]
Đáng chú ý năm 1976 I. W. Davidson và cộng sự thuộc trường đại học Edinburgh, vương quốc Anh đã tiến hành nghiên cứu alginate lyase từ vi khuẩn biển thuộc họ Pseudomonadaceae. Đây là enzyme ngoại bào thuộc
EC4.2.2.3 đã mở ra hướng nghiên cứu mới các chủng vi khuẩn biển được phân lập từ rong biển sống trong môi trường giàu alginate [55].
Mỗi chủng vi khuẩn thường sinh mỗi loại enzyme và đa số là enzyme Endolytic. Tuy nhiên, cũng có nhiều chủng vi khuẩn tạo ra nhiều hơn một enzyme như Pseudomonas alginovora có cả enzyme poly G và poly M [56]. Doubets và cộng sự [58] đã công bố alginate lyases (EC 4.2.2.3) thu từ 2 loài vi khuẩn biển A3, W3 được phân lập từ rong nâu Fucus. Trong đó, chủng vi khuẩn biển A3 sinh alginate lyase ngoại bào đặc hiệu Poly M và W3 sinh alginate lyase nôi bào đặc hiệu poly G [58].
Vi khuẩn là sinh vật có khả năng sinh sản nhanh, phát triển mạnh, thích ứng tốt với điều kiện công nghiệp. Môi trường dinh dưỡng để nuôi vi khuẩn rẻ tiền, dễ kiếm. Nên enzyme thu từ việc nuôi vi khuẩn sẽ nhanh hơn, rẻ hơn giúp tăng lợi nhuận. Bên cạnh đó, việc tìm kiếm alginate lyase mới từ vi khuẩn giúp dễ dàng hơn trong việc xác định gen mã hóa enzyme do bộ gen của vi khuẩn biển nhỏ hơn sơ với các sinh vật khác như vi nấm hay động vật biển, dẫn đến dễ dàng hơn trong việc nghiên cứu enzyme tái tổ hợp nhằm ứng dụng trong quy mô công nghiệp [68].
Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu trước đây cũng chỉ ra rằng các alginate lyase có khả năng kém trong ổn định nhiệt độ, hiệu suất xúc tác thấp để sản xuất AOS ở quy mô công nghiệp. Vì vậy, hiện nay các nhà khoa học tập trung vào tìm kiếm các alginate lyase từ vi khuẩn biển có hiệu suất cao, hoạt tính cao ứng dụng tiềm năng trong sản xuất alginate oligosaccharide như chủng vi khuẩn biển Bacillus sp. Alg07 [3].
1.3.2. Đặc tính xúc tác của một số alginate lyase từ vi khuẩn biển
Hầu hết alginate lyase được công bố từ vi khuẩn biển là enzyme ngoại bào như Pseudoalteromonas atlantica AR06 [69], Bacillus sp. TAG8 [5]. Điều này có thể được giải thích là do alginate là hợp chất đại phân tử, khó có thể hấp thu qua thành tế bào vi khuẩn. Do đó, các chủng vi khuẩn biển cần phải tiết ra môi trường enzyme chuyển hóa alginate thành alginate oligosaccharide để dễ dàng sử dụng cho hoạt động sống của chúng. Tuy
nhiên, một số vi khuẩn biển cũng được tìm thấy có sản xuất alginate lyase nội bào như Alteromonas sp. [61]. Điều này chứng tỏ, vi sinh vật biển có những cơ chế đặc biệt để có thể sử dụng các chất dinh dưỡng ở môi trường nhằm mục đích cung cấp nguồn năng lượng cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng. Vì vậy, khi tìm kiếm, nghiên cứu alginate lyase từ vi khuẩn biển cần phải tiến hành kiểm tra dịch chiết nội bào và ngoại bào để xác định đúng vị trí sản xuất của alginate lyase. Nhiều yếu tố, chẳng hạn như nguồn cacbon, nguồn nitơ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật và sản xuất alginate lyase. Tuy nhiên, chỉ có một vài báo cáo liên quan đến tối ưu hóa quá trình lên men, điều kiện nuôi cấy và vi sinh vật sản xuất alginate lyase [70], [71]. Hầu hết các công bố liên quan đến alginate lyase từ vi khuẩn biển đều sử dụng môi trường biển có bổ sung alginate là nguồn carbon cảm ứng vi khuẩn sinh enzyme [3], [70], [72], [73]. Do đó, khi nghiên cứu vi sinh vật sinh alginate lyase thì cần nghiên cứu ảnh hưởng của chất cảm ứng (bảng 1.3).
Bảng 1.3. Đặc tính xúc tác của một số alginate lyase từ vi khuẩn biển
STT Vi khuẩn biển Đặc hiệu enzyme Khối lượng phân tử (kDa) pH Nhiệt độ (toC) Đặc tính xúc tác, ảnh hưởng của các
ion kim loại
Nguồn tài liệu tham khảo
1 Vibrio furnissii H1 Poly M/
poly G 35,8 7,5 30
NaCl 0.3M, Zn2+, Fe2+, Cu2+,
Mn2+, Ag+
[64]
2 Bacillus sp. Alg07 Poly M 60 7,5 40 NaCl 0.2 M, Mg2+, Ca2+ [3] 3 Serratia marcescens NJ – 07 Poly M 25 9 40 NaCl từ 0.1- 0.3M, Zn2+, Cu2+, Mn2+, Co2+, Na+ [74] 4 Isoptericola halotolerans NJ-05 Poly M/ poly G 25,32 7 40 NaCl 0.1- 0.3M, Na+, Mg2+, Ca2+ , Cu2+ , Co2+, Fe3+ [75]
5 Flavobacterium sp. UMI-01 PolyM 30 7,5 55 NaCl 100 mM, MgCl2 , CoCl2, NiCl2 5mM [76] 6 Pseudoalteromonas sp. SM0524 Poly M/ poly G 32 8,5 50 NaCl 0.2M, Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Co2+ Ba2 +, Ni2+ và Sr2 . [7] 7 Enterobacter cloacae M-1 poly G 32 7,8 30 , EDTA, CaCl2, AlCl3, MnCl2, Mg2+, Ca2+ , Cu2+ , Co2+, Fe3+ [78]
8 Vibrio harveyi AL-
128 poly G 57 7,8 NaCl từ 0,3-1M Zn2+, Hg2+, Ag +, Cu2+, Mn2+, Pb2+, Fe3+ [66] 9 Alteromonas portus HB161718T Poly G 60 8 25 NaCl 0.1M, KCl 0.1M, Mg2+, Ca2+ và K+ Zn2+, Co2+ Li+ [79] 10 Bacillus sp. Poly G 60 8 50 NaCl 1.2 M, Mg2+, Ca2+, K+, Zn2+,Co2+,Li+ [80]
Các alginate lyase thu nhận từ các vi khuẩn biển Vibrio sp. được nghiên cứu phân lập, công bố có đặc trưng về điều kiện nhiệt độ từ 16oC – 40oC, pH 6,5-8,5 và ảnh hưởng bởi nồng độ muối NaCl cũng như các ion kim loại hóa trị II. Trong đó, Alginate lyase từ Vibrio furnissii H1 có KLPT 35,8 kDa, hoạt động tối đa ở nhiệt độ 40oC được xem hoạt động nhiệt độ cao nhất trong số các các enzyme từ Vibrio sp. và ổn định nhiệt ở 30oC, pH 7,5, nồng độ NaCl tối ưu cho alginate lyase hoạt động là 300 mM. Hoạt động của enzym bị ức chế bởi Zn2+, Fe2+, Cu2+, Mn2+ và Ag+. Tuy nhiên, K+ và Mg2+ thể hiện tăng cường hoạt động enzyme [64].
Mỗi loài vi khuẩn sinh ra alginate lyase có những đặc tính khác nhau như KLPT, điều kiện hoạt động và tính đặc hiệu cơ chất. Alginate lyase có
nguồn gốc từ chủng vi khuẩn biển Bacillus sp. Alg07 có KLPT khoảng 60 kDa, hoạt động tối ưu ở 40oC, pH 7,5, nồng độ NaCl tối ưu cho alginate lyase là 200 mM, Mg2+, Ca2+ tăng cường sự hoạt động của enzyme. Là một alginate lyase đặc hiệu poly M và trong điều kiện tối ưu đạt tới 8306,7 U/mg và được xem là hoạt động cao nhất trong số các alginate lyase [3]. Vì vậy, alginate lyase có nguồn gốc từ chủng vi khuẩn biển Bacillus sp. Alg07 được đánh giá là có tiềm năng rất lớn để sản xuất quy mô công nghiệp.
Alginate lyase từ chủng vi khuẩn Serratia marcescens NJ – 07 được Benwei Zhu và công sự (2019) công bố, Aly NJ-07 chỉ đặc hiệu với poly M có KLPT 25 kDa và thể hiện mức hoạt động tối đa 2742,5 U/mg đối với muối natri alginate, hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 40oC, pH 9, NaCl từ 100 – 300 mM. Tác giả nhận thấy rằng Na+ có thể tăng cường hoạt động của enzyme, trong khi một số ion hóa trị hai như: Zn2+, Cu2+, Mn2+, Co2+ ức chế hoạt động của enzyme. Aly NJ-07 là endolytic có khả năng nhận biết trisaccharide và phân cắt các trisaccharide thành monosaccharide và disaccharide [74].
Alginate lyase đặc hiệu poly M và poly G được thu nhận từ chủng vi khuẩn Isoptericola halotolerans NJ-05 phân lập từ rong nâu có KLPT 25,32 kDa, enzyme hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 40oC, pH 7, các ion kim loại Na+, Mg2+, Ca2+ có thể tăng cường sự hoạt động của enzyme trong khi các ion Cu2+, Co2+, Fe3+ lại ức chế sự hoạt động của alginate lyase. Do enzyme đặc hiệu cả poly M và poly G nên nó có thể thủy phân alginate giải phóng một loạt các oligosaccharide như disaccharide, trisaccharide và tetrasaccharide [75].
Alginate lyase thuộc họ polysaccharide lyase số 7 đặc hiệu poly M từ loài vi khuẩn biển Flavobacterium sp. UMI-01 có KLPT 30 kDa, điều kiện hoạt động tối ưu của enzyme ở nhiệt độ 55oC, pH = 7,7, NaCl 100mM và MgCl2 5mM tăng cường hoạt động của enzyme thêm 30% trong khi CoCl2
5mM và NiCl2 5mM thì có tác dụng kìm hãm sự hoạt động của enzyme. Đây là chủng vi khuẩn biển sinh enzyme alginate được đánh giá có khả năng cao trong sản xuất alginate oligosaccharide vì chúng có hiệu suất xúc tác cao [76].
Chủng vi khuẩn Pseudoalteromonas sp. SM0524 được phân lập từ tảo bẹ biển bị thối rữa sinh alginate lyase đặc hiệu poly M và poly G. KLPT enzyme 32 kDa hoạt động trong điều kiện tối ưu về nhiệt độ 50oC, pH 8,5. Nồng độ NaCl tối ưu là 0,2 M và chịu tác động của ion kim loại Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Co2+, Ba2+, Ni2+ và Sr2+. Đây là enzyme tiềm năng để sản xuất alginate KLPT thấp [7].
Alginate lyase đặc hiệu poly G từ vi khuẩn được phân lập ở rong
Sargassum fluitans cho thấy chúng hoạt động mạnh khi có mặt của NaCl
0,5M, enzyme có KLPT 38 kDa và có pI = 4,5 [77]. Hoặc đối với enzyme alginate lyase đặc hiệu poly G từ Enterobacter cloacae M-1 có KLPT 38 kDa và 32 kDa, pI = 8,9, pH = 7,8, nhiệt độ thích hợp là 30oC, enzyme không bền với nhiệt, EDTA hoàn toàn ức chế hoạt tính của enzyme, nhưng hoạt tính của enzyme phục hồi lại được khi xử lý với CaCl2, AlCl3, MnCl2, các ion Mg2+, Ca2+, Cu2+, Co2+, Fe3 ức chế sự hoạt động của enzyme [78].
Enzyme alginate ngoại bào từ vi khuẩn Vibrio harveyi AL-128 có KLPT 57 kDa, hoạt động tốt ở nồng độ NaCl từ 0,3-1M, các ion Zn2+, Hg2+, Ag+, Cu2+, Mn2+, Pb2+, Fe3+, EDTA ức chế hoạt động của enzyme, [66].
Ngoài những alginate lyase hoạt động theo endolytic hay exolytic thì có những enzyme hoạt động cùng lúc cả endolytic và exolytic như enzyme Alg2951 từ vi khuẩn Alteromonas portus HB161718T KLPT 60 kDa hoạt động tối đa ở nhiệt độ 25oC, pH 8. Cả NaCl 100 mM, KCl 100 mM đều thúc đấy sự hoạt động của enzyme. Các ion kim loại Mg2+, Ca2+ và K+ làm tăng hoạt tính của enzyme trong khi Zn2+, Co2+ và Li+ ức chế mạnh. Alg2951 đặc hiệu poly G thủy phân alginate thành các monosaccharide và trisaccharide [79].
Năm 2019, Zilda và cộng sự đã phân lập chủng vi khuẩn từ rong
Turbinaria, vi khuẩn phân lập thuộc loài Bacillus sp. sinh alginate lyase
T513. Enzyme hoạt động tối ưu trong điều kiện nhiệt độ 50oC, pH 8, các ion kim loại ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme gồm: Mg2+, Ca2+, K+, Zn2+, Co2+, Li+, nồng độ NaCl ở 1,2 M thì enzyme không hoạt động. Đây là một trong ít chủng vi khuẩn phân lập từ rong Turbinaria được công bố [80].
Nam
1.3.3. Tình hình nghiên cứu alginate lyase từ vi khuẩn biển ở Việt
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu alginate lyase vẫn còn trong giai đoạn tìm kiếm, bước đầu đã nghiên cứu tách chiết được enzyme từ một số nguồn vi khuẩn biển, vi khuẩn đất và động vật thân mềm.
Nguyễn Ngọc Hữu [81] đã nghiên cứu tách chiết được enzyme thủy phân alginate từ loài vi khuẩn Klebsiella sp. có hoạt độ xác định theo phương pháp độ nhớt là 12ml/20phút (nghĩa là với 12ml dung dịch enzyme thủy phân cắt mạch alginate làm cho độ nhớt dung dịch alginate 1% giảm xuống 50% trong 20 phút). Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme từ 30oC - 40oC. Đây là nghiên cứu bước đầu về khả năng cắt mạch alginate của alginate lyase từ vi khuẩn Klebsiella sp.. Các enzyme thu được chưa tinh sạch, chưa xác định được đặc tính xúc tác đặc hiệu của enzyme.
Ngô Thị Duy Ngọc [82] đã nghiên cứu thu nhận enzyme alginate lyase từ ốc bàn tay (Lambis chiragra) và nhận thấy enzyme có KLPT khoảng 32 kDa, nhiệt độ thích hợp cho hoạt động là 40oC, pH thích hợp từ 7,5 ÷ 8,0, nồng độ NaCl 0,2M cho hoạt động cao nhất. Các ion kim loại (Ca2+, Mg2+, Mn2+) có tác dụng hoạt hóa enzyme, còn đối với các ion Ag+, Cu2+, Fe2+, Zn2+
lại ức chế hoạt tính enzyme.
Năm 2020, Võ Thị Diệu Trang và cộng sự đã nghiên cứu được 35 chủng vi khuẩn biển từ bọt biển sinh enzyme cắt mạch polysaccharide trên chất nền alginate, fucoidan được chiết xuất từ rong nâu S. mcclurei. Trong đó, có 68,6% chủng sinh alginate lyase trên chất nền alginate từ S. mcclurei. Công trình nghiên cứu cho thấy tiềm năng lớn trong việc tìm kiếm các vi khuẩn biển sinh alginate lyase đặc hiệu ở Việt Nam [83].
Các công trình nghiên cứu về chủng vi khuẩn biển B. velezensis AlgSm1 đã được công bố có khả năng sinh alginate lyase bẻ mạch alginate chiết từ rong S. mcclurei thu nhận tại vùng biển Khánh Hòa [83]. Cao Thị Thúy Hằng và công sự [85] đã tiên hành khảo sát điều kiện lên men của chủng vi khuẩn này và xác định điều kiện sản sinh alginate lyase tốt nhất là
pH 5,5, nguồn carbon là alginate 5 mg/ml, nguồn nitơ là 0,8 mg/ml, thời gian lên men là 18 giờ, nuôi cấy ở 28-30°C. Đây là cơ sở cũng như là tiềm năng nghiên cứu về vi khuẩn biển sinh alginate lyase ở nước ta nơi vùng biển có trữ lượng lớn về rong nâu để sản xuất alginate.
Như vậy, ở Việt Nam hiện nay chúng ta cần phải tiếp tục tìm kiếm và xác định đặc tính xúc tác của alginate lyase nhằm cung cấp công cụ để sản xuất alginate oligosaccharide ứng dụng trong các lĩnh vực thực phẩm, thực phẩm chức năng và y dược.
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Thời gian thực nghiệm: từ tháng 4/2021 đến tháng 9/2021
Địa điểm nghiên cứu: Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang.
2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU2.2.1 Vật liệu thí nghiệm 2.2.1 Vật liệu thí nghiệm
2.2.1.1. Nguồn cơ chất
Alginate chiết xuất từ rong Sargassum mcclurei (S. mcc A) và
Turbinaria ornata (T. o A) được cung cấp bởi phòng Hóa phân tích và triển
khai công nghệ, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang. S. mcc A có KLPT 505 kDa, T. o A có KLPT 325 kDa được xác định bằng phương pháp sắc ký GPC (Phụ lục 1), hàm lượng uronic acid tổng số lớn hơn 90%.
2.2.1.2 Nguồn phân lập vi khuẩn biển
Các mẫu rong nâu được thu ở các địa điểm của vùng biển Khánh Hòa ở độ sâu 3-5m vào tháng 4/2021 (hình 2.1). Các mẫu rong biển sau khi được thu thập, phân loại được cho vào túi trữ mẫu, bảo quản ở nhiệt độ 4ºC và vận chuyển về phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập vi khuẩn.
Quá trình thu mẫu đã thu được 05 mẫu rong ở vùng biển Khánh Hòa (hình 2.1) gồm: (1) rong Hormophysa articulate, (2) rong Sargassum
oligocystum, (3) rong Turbinaria ornata, (4) rong Padina australis, (5) rong Sagassum polycystum.
2.2.2. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm
Dụng cụ: - Đĩa petri - Que cấy trang - Que cấy vòng
- Ống Cryotube để giữ giống
- Các loại ống đong 100ml; 500ml;1000ml - Bình tam giác 500ml; 1000ml
- Pipet
- Nước biển vô trùng đựng trong bình tam giác
Thiết bị: Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: - Cân phân tích CP224S Sartorius 31
- Hệ thống sắc ký lọc gel GPC-2414 Waters-Mỹ
- Máy đo quang: SHIMADZU UV-VIS 1601PC
SPECTROMETER
2.2.3. Môi trường nuôi cấy.
Môi trường phân lập MBA: Các thành phần cho 01 lít nước bao gồm:
- Pepton: 10g - Alginate: 10g - KH2PO4: 0,1g - MgSO4.7H2O: 0,1g - Nước cất: 500ml - Nước biển: 500ml
- pH 7,5-7,8 để phân lập vi khuẩn biển