2. Nội dung chi tiết của đề cương luận văn thạc sĩ
2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ, MÁY MÓC
2.1.1. Vật liệu
Các chủng VKTQH Rhodopseudomonas sp. 311, Rhodobacter sp. NDT6, Rhodobacter sp. 86 và Rhodopseudomonas sp. 517 (được phân lập từ vùng ven biển Nam Định, Thanh Hóa) đã được tuyển chọn có giá trị dinh dưỡng cao nhất. Chúng đã được nghiên cứu kỹ các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và vị trí phân loại cũng như các điều kiện tối ưu như nhiệt độ, pH, nồng độ muối và cường độ ánh sáng trên môi trường cơ bản cho VKTQH sinh trưởng.
2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng đều là hóa chất ngoại nhập của hãng Sigma, Merk, Trung Quốc và Việt Nam sản xuất.
2.1.3. Môi trường
Môi trường nuôi cấy VKTQH không lưu huỳnh trong phòng thí nghiệm là môi trường DSMZ 27 bao gồm các thành phần sau: cao nấm men (0,3 g/l), succinate - Na (1 g/l), acetate (0,5 g/l), K2HPO4 (1g/l), KH2PO4 (0,5 g/l), MgSO4.7H2O (0.4 g/l), CaCl2.2 H2O (0,05 g/l), NH4Cl (0,4 g/l), vi lượng SL6(*) (1 ml/l), dung dịch vitamin B12(**)(0,4 ml/l), Nước cất (1000 ml), NaCl
(20 g/l), pH (6,8).
Dung dịch vi lượng SL6(mg/l): HCl (25%) 6,5 ml; FeCl2.4H2O 1,5 g; H3BO3 0,3 g; MnCl2.2H2O 0,03 g; CoCl2.6H2O 0.2 g; ZnSO4. 7H2O 0,1 g;
CuCl2.2H2O 17 mg; NiCl2.6H2O 24 mg; Na2MoO4.2H2O 36 mg, H2O 993 ml.
Dung dịch vitamin B12: 10 mg trong 100 ml nước được khử trùng bằng màng lọc và bổ sung vào môi trường trước khi sử dụng.
Sử dụng môi trường DSMZ 27 cải tiến có bổ sung 1,4 gGlutamat và 0,6 g Malatethay succinate - Na (1 g/l); acetate (0,5 g/l).
Dung dịch Bradford: Hòa tan 100 mgCoomassie Brilliant Blue G-250 (CBB) trong 50 ml ethanol 96%, thêm 100 ml H3P0485%, bổ sung nước cất vừa đủ 1000 ml; dung dịch đệm lysis: 9 g NaCl và 12 g NaOH hòa tan trong nước cất đến thể tích cuối cùng là 1000 ml; dung dịch chuẩn BSA (albumine huyết thanh bò) 100 mg/l.
2.1.4. Các thiết bị máy móc
Các thiết bị máy móc được sử dụng bao gồm thiết bị của Phòng Công nghệ sinh học môi trường Viện Công nghệ sinh học. Các thiết bị bao gồm:
Tên thiết bị, máy móc
Tủ nuôi cấy vi sinh Bình khí nitơ
Máy quang phổ NOVASPEC II Máy quang phổ UV - 1650PC Cân phân tích Mettler toldo Máy ly tâm lạnh CT15RE HiMac Máy Vortex
Máy đo Ph Máy lắc ổn nhiệt Bể ổn nhiệt
Máy hút chân không Speed- Vac 110A Tủ lạnh thường GR-K22EA
Tủ lạnh sâu -20
Box cấy Biocyt ESI Flufrance Kính hiển vi quang học Olympus
Chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử JEM1010
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Đánh giá sinh trưởng và xác định mật độ của VKTQH
Sinh trưởng của các chủng VKTQH được đánh giá bằng cách xác định độ hấp phụ của dịch huyền phù tế bào tại bước sóng 800 nm (OD 800), vì trong tế bào VKTQH Bchl có cực đại hấp thụ ở 800 nm và độ hấp thụ này tỷ lệ với hàm lượng Bchl và do vậy tỷ lệ thuận với sinh khối của tế bào. Các chỉ số này được đo trên máy quang phổ Novaspec II hoặc máy quang phổ UV - 1650PC.
Mật độ được xác định theo phương pháp pha loãng như sau: mẫu được pha loãng liên tục bằng nước cất vô trùng từ 101 đến 1014. Dùng pipet vô trùng lấy 50 µl dung dịch ở các nồng độ thích hợp nhỏ lên bề mặt đĩa thạch chứa môi trường DSMZ 27. Dùng que gạt vô trùng dàn đều dịch đó trên mặt thạch. Đặt các đĩa thạch chứa mẫu VKTQH trong điều kiện khí quyển nitơ, dưới ánh sáng đèn sợi đốt 60w, tiến hành đếm số khuẩn lạc sau 5 -7 ngày.
Số lượng khuẩn lạc (CFU) xuất hiện trên đĩa được đếm và tính theo công thức: CFU/ml = a ×1/v×n
Trong đó: n là độ pha loãng mẫu, a là số khuẩn lạc đếm được trên bề mặt đĩa thạch, v là thể tích mẫu được cấy, 1/v thể tích mẫu qui về 1 ml.
Mật độ tế bào VKTQH còn được xác định theo phương pháp MPN.
2.2.2. Phương pháp nuôi vi khuẩn tía quang hợp làm thức ăn trong môi trường có bổ sung nguồn carbon khác nhau
VKTQH có khả năng sử dụng được nhiều nguồn carbon hữu cơ cho
sinh trưởng. Để xác định khả năng sử dụng một số nguồn carbon cho sinh
trưởng của 4 chủng VKTQH sử dụng làm thức ăn, chúng tôi đã nuôi cấy
chúng trong môi trường DSMZ 27 dịch thể thí nghiệm được tiến hành ở điều
kiện kỵ khí sáng. Khả năng sinh trưởng của chúng được ghi nhận sau 5 ngày
nuôi cấy.
Sinh khối VKTQH thu được ở cuối pha log được ly tâm ở các tốc độ vòng 8000 vòng/phút để thu sinh khối tích lũy được khi nuôi trên các nguồn carbon khác nhau.
2.2.3. Định lượng Protein bằng phương pháp Bradford
Các protein sẽ phản ứng với thuốc thử Coomassie (Coomassie Brilliant Blue G-250) hình thành hợp chất màu xanh có khả năng hấp thụ ánh áng ở bước sóng 595 nm [48].
Tiến hành: Dịch nuôi cấy vi khuẩn được cho vào ống eppendorf ly tâm ở 8000 vòng/phút loại dịch nổi. Tủa được hòa lại trong đệm lysis và giữ ở bể ổn nhiệt ở 90oC trong 30 phút. Sau khi ly tâm 13000 vòng/phút (15) phút, 0,8 ml dịch nổi được bổ sung 0,2 ml thuốc thử Bradford, chờ 2 phút đo độ hấp thụ ở A595. Dựng đồ thị chuẩn protein từ dung dịch BSA 100 mg/l với các nồng độ 2, 4, 6, 8, 10 mg/l. Tính lượng protein tế bào có trong mẫu nghiên cứu dựa vào đồ thị chuẩn sử dụng albumine huyết thanh bò (BSA) làm chất chuẩn.
2.2.4. Phương pháp nuôi cấy VKTQH không lưu huỳnh
Trong phòng thí nghiệm: VKTQH được nuôi trong ống thủy tinh có nắp đậy caosu hoặc trong các bình thủy tinh hình trụ có thể tích chứa dịch môi trường DSMZ 27. Môi trường trong các bình và các ống thủy tinh được sục khí nitơ qua màng lọc vô trùng thay thế khí oxy trong môi trường sao cho nồng độ oxy hòa tan 0 mg/l. Giống VKTQH được nuôi trong ống thủy tinh V= 12 ml hoặc bình thủy tinh V=100 ml chứa môi trường DSMZ 27 ở điều kiện kỵ khí, sáng và khi sinh trưởng của chúng ở pha log với mật độ tế bào khoảng 109CFU thì được cấy vào bình thí nghiệm khoảng 5 - 10% (v/v) để đạt mật độ ban đầu OD800 khoảng 0,1 và bổ sung hàm lượng sulfide là 10 mgS2-/l để theo dõi sinh trưởng và hoạt tính loại bỏ sulfide (xác định thông qua hàm lượng sulfide còn lại trong môi trường nuôi) của các chủng VKTQH.
Ngoài tự nhiên: VKTQH được nuôi trong các bể kính và bể nhựa với các thể tích khác nhau: 10ml, 50 ml, 100ml, 200ml. VKTQH được nuôi trên môi trường DSMZ 27 cải tiến có bổ sung1,4 g glutamat và 0,6 g malate.
2.2.5. Phương pháp thu sinh khối VKTQH
Phương pháp ly tâm
Ở phương pháp này sẽ sử dụng máy ly tâm với 6 tốc độ quay khác nhau: 3000 vòng/phút, 4000 vòng/phút, 5000 vòng/phút, 6000 vòng/phút, 7000 vòng/phút và 8000 vòng/phút trong 5 phút. 35ml mẫu được chuyển vào ống ly tâm 50ml. Khả năng tích lũy sinh khối (OD800) được kiểm tra trước và sau khi ly tâm để đo hiệu quả thu hoạch. Sau đó sinh khối VKTQH được hoà tan để thu được dung dịch đậm đặc. Dung dịch đậm đặc được nuôi cấy trong các bình thử nghiệm chứa môi trường DSMZ 27 lỏng cho đến khi OD800
khoảng 0,1- 0,2. Các bình thử nghiệm được nuôi cấy trong điều kiện yếm khí với ánh sáng đèn sợi đốt ở 5000 lux. Sự phát triển của dung dịch đậm đặc sinh khối ở các tốc độ khác nhau được theo dõi trong 5 ngày.
Phương pháp lắng tủa hóa học
Phương pháp này sẽ được thử nghiệm trên ba chất đông tụ hóa học, nhôm polyclorua, nhôm sunfat và sunfat sắt với những liều lượng khác nhau. Hỗn hợp VKTH trong nuôi cấy thử nghiệm (với ∆OD800 khoảng 2,0 - 2,5) được cho vào các bình 100 ml. Nồng độ nhôm sunphat, sắt sunphat được kiểm soát theo cấp độ từ 500 đến 4000 mg.L-1. Nồng độ nhôm polychloride được kiểm soát theo cấp độ từ 1000 đến 8000 mg.L-1 .Các bình sau đó được đặt trên máy lắc với tốc độ 100 vòng / phút trong 15 phút. Sau khi đông tụ, các mẫu được để lắng trong 60 phút. Sau khi lắng, 5 mL mẫu được thu thập từ giữa các bình và xác định phần trăm tế bào bị loại bỏ.
Phương pháp lắng tủa sinh học bằng tủa chitosan
Sinh khối VKTQH được nuôi trong môi trường DSMZ -27 cải tiến, nuôi ở điều kiện kỵ khí sáng, Hỗn hợp VKTH trong nuôi cấy thử nghiệm (với
khoảng 2,0 - 2,5) được cho vào các bình 100 ml. Nồng độ chitosan được kiểm soát theo cấp độ từ 50 đến 250 mg.L-1. Các bình sau đó cũng được đặt vào máy lắc với tốc độ 100 vòng/phút trong 15 phút. Sau khi đông tụ, các mẫu được để lắng trong 60 phút. Sau khi lắng, 5 mL mẫu được thu thập từ giữa các bình và xác định phần trăm tế bào bị loại bỏ.
Hiệu suất lắng tủa được tính theo công thức:
Hiệu suất lắng tủa = (ODban đầu – ODsau lắng)/ ODbanđầu x100%
2.2.6. Phương pháp tạo chế phẩm dạng lỏng sệt
Phương pháp tạo chế phẩm dạng lỏng sệt bằng tinh bột biến tính
Sinh khối sau khi thu hồi bằng phương pháp tủa chitosan được sử dụng tạo chế phẩm dạng lỏng sệt có bổ sung tinh bột biến tính. Tinh bột được hồ hóa ở trạng thái gel với tỷ lệ 2, 3, 4, 5% sau đó để nguội rồi tiến hành tạo chế phẩm VKTQH dạng lỏng sệt bằng cách bổ sung sinh khối thu được với các tỷ lệ 2VK:1TB, 1VK:1TB và tỷ lệ 1VK:2TB
Tinh bột biến tính được hồ hóa ở các nồng độ khác nhau sau đó được bổ sung sinh khối VKTQH sao cho mật độ ban đầu của chế phẩm khoảng 1014. Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ tinh bột biến tính bổ sung thích hợp để tạo chế phẩm VKTQH dạng lỏng sệt. Sau khi tạo chế phẩm theo dõi mật độ tế bào trong 7 ngày.
Phương pháp tạo chế phẩm dạng lỏng sệt bằng CMC
Sinh khối sau khi thu hồi bằng phương pháp tủa chitosan được sử dụng tạo chế phẩm dạng lỏng sệt có bổ sung CMC ở các nồng độ khác nhau. CMC được hòa tan ở hai điều kiện nhiệt độ thường và đun nóng để CMC tan hoàn toàn trong nước với các nồng độ 1, 2, 3% sau đó được bổ sung sinh khối VKTQH sao cho mật độ ban đầu của chế phẩm khoảng 1014. Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ CMC bổ sung thích hợp để tạo chế phẩm VKTQH dạng lỏng sệt. Sau khi tạo chế phẩm chúng tôi theo dõi mật độ tế bào trong 7 ngày.
download by : skknchat@gmail.com
Phương pháp tạo chế phẩm dạng lỏng sệt bằng carrageenan:
Sinh khối sau khi thu hồi bằng phương pháp tủa chitosan được sử dụng tạo chế phẩm dạng lỏng sệt có bổ sung carrageenan ở các nồng độ khác nhau. Carrageenan được hồ hóa ở các nồng độ từ từ 0,2 – 1%, Carrageenan được hòa tan trong nước, đun nóng đến khi tan hoàn toàn ở nhiệt độ 80oC. Khi các dung dịch gel nguội đến 38oC, tiến hành bổ sung sinh khối VKTQH với tỷ lệ 1:1. Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ carrageenan bổ sung thích hợp để tạo chế phẩm VKTQH dạng lỏng sệt. Sau khi tạo chế phẩm chúng tôi theo dõi mật độ tế bào trong 7 ngày.
2.2.7. Phương pháp xử lý thống kê sinh học
Số liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm ± độ lệch chuẩn (Standard Deviation - SD). Sử dụng phương pháp xử lý thống kê sinh học bằng phần mềm Excel và phương pháp kiểm định phân tích phương sai một yếu tố (oneway - ANOVA) để so sánh sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa là α = 0,05.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN SẢN XUẤT SINH KHỐI VKTQH KHÔNGLƯU HUỲNH LƯU HUỲNH
3.1.1. Tối ưu nguồn carbon
VKTQH có thể sử dụng nhiều nguồn carbon cho sự phát triển của chúng và chúng có sự trao đổi chất linh hoạt trong các môi trường sống khác nhau. Các chủng VKTQH lựa chọn sinh trưởng, phát triển tốt trong môi trường DSMZ-27 nhưng với mục đích gia tăng mật độ cũng như giá trị dinh dưỡng khi ứng dụng VKTQH làm thức ăn cho con giống thủy sản hai mảnh vỏ, chúng tôi đã tiến hành lựa chọn nguồn carbon bổ sung vào môi trường nuôi. Từ đó xác định khả năng tích lũy sinh khối của hỗn hợp các chủng lựa chọn trong môi trường DSMZ-27, trong đó nguồn carbon của môi trường gốc được loại bỏ hoàn toàn và lần lượt được thay thế bằng các nguồn carbon khác nhau (với nồng độ 2 g/l) như: acetate, succinate, glutamate, malate, butyrate, fructose, glucose, saccarose, lactose và rỉ đường. Kết quảđược đánh giá sau 5 ngày nuôi cấy trong điều kiện kỵ khí-sáng thể hiện trên Hình 3.1 và Hình 3.2
∆ O D 8 00 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 Nguồn carbon
Hình 3.1.Mức độ tích lũy sinh khối trong môi trường chứa nguồn carbon khác nhau
Rỉ đường Glutamate GlucoseButyrate Saccarose Malate Succinate Acetate lactose Fructose DSMZ-27
Hình 3.2.Hình ảnh hỗn hợp VKTQH nuôi trong môi trường chứa nguồn carbon khác nhau
Từ biểu đồ ở Hình 3.1 cho thấy hỗn hợp VKTQH đều có khả năng sinh trưởng tốt trên các ngồn carbon đã thử nghiệm ( OD800 khoảng 1,5-2,5). Trong đó tốt nhất là trên nguồn malate, glutamate, rỉ đường và succinate. Hầu hết các VKTQH không lưu huỳnh phát triển tốt trong môi trường có chứa các hợp chất hữu cơ như malate hoặc pyruvate [49]. Carbon là nguồn cần thiết cho sự phát triển và sản xuất các chất chuyển hóa của vi sinh vật vì chúng rất quan trọng trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. VKTQH có thể sử dụng nhiều nguồn carbon cho sự phát triển của chúng. Đã có báo cáo rằng các nguồn carbon axit cacboxylic bốn carbon như malate, succinat, v.v. và các nguồn nitơ có chứa nhóm amin giúp VKTQH không lưu huỳnh phát triển tốt hơn và tạo ra nhiều sắc tố hơn trong điều kiện yếm khí [9, 50]. Các chủng VKTQH cũng tạo ra nhiều sinh khối hơn khi nuôi cấy trên môi trường có chứa glucose hoặc maltose làm nguồn carbon.
3.1.2.Kết quả đánh giá hàm lượng protein thô trong tế bào khi nuôi cấy trên các nguồn C khác nhau
Đối với thức ăn trong chăn nuôi cũng như trong nuôi trồng thủy sản thì hàm lượng protein trong thức ăn là vô cùng quan trọng, Protein không chỉ có chức năng như chất dinh dưỡng mà còn thực hiện nhiều chức năng khá như xúc tác cho các phản ứng sinh hóa, Điều hòa sự trao đổi chất, protein đảm nhiệm nhiều chức năng liên quan đến toàn bộ hoạt động sống của tế bào, quy
định các tính trạng và các tính chất của cơ thể sống [51-54]. Việc sử dụng sinh khối VKTQH làm nguồn protein đơn bào là nguồn cung cấp thay thế bền vững [55]. Do vậy, kết quả tìm kiếm nguồn carbon ngoài việc đánh giá khả năng sinh trưởng, chúng tôi còn đánh giá % hàm lượng protein thô có trong tế bào. Kết quả được trình bày trên Hình 3.3.
P ro te in 8070 60 50 % 40 30 20 10 0 Nguồn carbon
Hình 3.3.Hàm lượng protein thô tổng hợp được khi hỗn hợp nuôi trên các nguồn carbon khác nhau
Kết quả cho thấy hầu hết tỷ lệ protein thô trong tế bào VKTQH khi nuôi trên môi trường chứa các nguồn C khác nhau khá cao (từ 61,4- 68.9 %), trong đó cao nhất là malate, glutamate, succinate, rỉ đường cao nhất và thấp dần ở môi trường chứa nguồn C là fructose, butyrate, lactose, glucose, saccarose, acetate. Kết quả còn cho thấy hàm lượng protein thô trong tế bào VKTQH khi nuôi ở môi trường chứa nguồn C là malate, glutamate, succinate có hàm lượng protein cao hơn so với môi trường đối chứng DZMZ -27. Có thể nói khi nuôi trên các môi trường chứa các nguồn carbon khác nhau thì thu được hàm lượng sinh khối khác nhau và hàm lượng protein thô cũng khác nhau. Anupama và Ravindra (2000) cho rằng sản xuất protein đơn bào từ VKTQH có nhiều lợi thế hơn các nhóm khác. Hàm lượng protein thu được khi nuôi từ hỗn hợp VKTQH trên các nguồn C đều cao hơn các chủng vi khuẩn quang hợp khác như Rhodobacter sphaeroides P47 từ chất thải dứa
(6,6%), Rhodobacter sphaeroides Z08 từ nước thải đậu nành (52%) [56],
Rhodocyclus gelatinosus từ chất thải trại lợn (50,6%) [27]. VKTQH là những vi sinh vật đầy hứa hẹn có thể được sử dụng làm nguồn protein [57, 58]. Là
