3. NỘI DUNG THỰC HIỆN
2.4.5. Thiết kế mồi
Trong nghiên cứu này, mồi (primer) được thiết kế cho phương pháp multiplex ARMS-PCR nhằm phát hiện một số đột biến thường gặp tại Việt Nam.
Với beta thalassemia: mồi được thiết kế cho multiplex ARMS-PCR phát hiện 9 đột biến thông thường được chia thành 3 quy trình nhỏ. Trong đó quy trình beta 1 phát hiện các đột biến: CD95; CD41/42; IVS1-5; CD17. Quy trình beta 2 phát hiện các đột biến:CD 26 (HbE); IVS I-1;. Quy trình beta 3 phát hiện các đột biến nt-28; CD71/72; IVSII-645. Trình tự mồi và kích thước sản phẩm DNA được thể hiện ở các bảng dưới đây:
Quy trình beta 1:
Tên mồi Trình tự mồi (5’ - 3’) Kích thước
IVS I-5 CTCCTTAAACCTGTCTTGTAACCTTGTTAG 285
Cd 17 CTCACCACCAACTTCATCCACGTTCAGCTA 240
Cd 41/42 GAGTGGACAGATCCCCAAAGGACTCAACCT 443
Cd95 TCA GGA TCC ACG TGC AGC TTT 600
Quy trình beta 2:
Tên mồi Trình tự mồi (5’ - 3’) Kích thước
Cd26 TAACCTTGATACCAACCTGCCCAGGGCGTT 502
Quy trình beta 3:
Tên mồi Trình tự mồi (5’ - 3’) Kích thước
Nt-28 AGGGAGGGCAGGAGCCAGGGCTGGGCTTAG 649
Cd 71/72 CATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGCCTTTAAG 238
IVS II-654 GAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAACGT 829
Với alpha thalassemia: trình tự mồi được thiết kế để phát hiện đồng thời 5 đột biến xoá đoạn a3.7; a4.2; SEA, THAI, FIL trong 1 phản ứng.
Tên mồi Trình tự (5’-3’) Kích thước SEA F CTCTGTGTTCTCAGTATTGGAGGGAAGGAG 660 SEA R ATATATGGGTCTGGAAGTGTATCCCTCCCA FIL F AAGAGAATAAACCACCCAATTTTTAAATGGGCA 550 FIL R GAGATAATAACCTTTATCTGCCACATGTAGCAA THAI F CACGAGTAAAACATCAAGTACACTCCAGCC 411 THAIR TGGATCTGCACCTCTGGGTAGGTTCTCTACC 3.7 F CCCCTCGCCAAGTCCACCC 2020 3.7R AAAGCACTCTAGGGTCCAGCG 4.2 R CCCGTTGGATCTTCTCATTTCCC 1628 4.2 F GGTTTACCCATGTGGTGCCTC α2 R AGACCAGGAAGGGCCGGTG 1800 α2 F CCCCTCGCCAAGTCCACCC
Hình 2.2. Vị trí primer xác định đột biến trên alpha globin gen 2.4.6. Quy trình multiplex PCR xác định đột biến gen thalassemia
Với alpha thalassemia.
Bước 1: Chuẩn bị phản ứng PCR STT Sinh phẩm Thành phần (µl)/1 pứ 1 H2O 5,5 2 2X GoTaq Green MM 12,5 3 DMSO 1,0 4 Hỗn hợp mồi 5,0 5 DNA 1,0 Tổng thể tích 25,0
Bước 2: Thực hiện cácchu kỳ nhiệt.
Bước 3: Điện di sản phẩm PCR trên agarose gel. Bước 4: Đọc kết quả.
Với beta thalassemia: Các bước thao tác tương tự như alpha thalassemia nhưng lần lượt theo thứ tự quy trình beta 1, 2, 3. Nếu phát hiện đột biến ở quy trình trước thì không cần thực hiện quy trình sau. Quy trình chi tiết xin xem phụ lục 3.
2.5. Phân tích số liệu
Các số liệu được phân tích bằng phần mềm thống kê y học SPSS 20.
2.6. Đạo đức trong nghiên cứu
Nghiên cứu được thông qua bởi hội đồng khoa học trường Đại học Khoa Học - Đại học Thái Nguyên; Ban giám đốc bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên. Đối tượng nghiên cứu được phổ biến quyền lợi và quyền quyết định tự nguyện tham gia/không tham gia nghiên cứu.
Thông tin cá nhân đối tượng nghiên cứu được mã hoá và chỉ được sử dụng cho mục đích nghiên cứu phi lợi nhuận.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tách chiết DNA
DNA của các bệnh nhân cùng DNA mẫuđối chứng được tách chiết bằngQIAGEN Kit như mô tả ở phần phương pháp. Sau khi tách chiết, các mẫu DNA được kiểm tra nồng độ, độ tinh sạch bằng phương pháp đo phổ hấp thụ tử ngoại ở bước sóng 260 nm và 280 nm trên máy Nano-Drop và điện di DNA tổng số trên gel agarose 1%.
Hình 3.1. Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của một mẫu sản phẩm DNA. (Tỷ lệ OD 260/280 của mẫu này là 1,87 trong khoảng cho phép từ 1,8-2,0
nồng độ DNA là 545,1ng/ul.)
Nồng độ DNA tổng số tách được có giá trị trên 200ng/l và độ tinh sạch của các mẫu đạt yêu cầu với tỷ lệ mật độ quang đo được ở bước sóng 260/280 nm luôn nằm trong khoảng 1,8-2,0.
Hình 3.2. Hình ảnh điện di DNA tổng số tách chiết từ máu ngoại vi của các đối tượng nghiên cứu
Hình ảnh điện di DNA tổng số tách chiết từ máu ngoại vi của bệnh nhân thalassemia lên vạch rõ nét, không bị đứt gãy và có thể sử dụng để phân tích đột biến.
Kỹ thuật sinh học phân tử đang ngày càng phát triển và có những đóng góp rất lớn trong lĩnh vực khoa học nói chung và y học nói riêng. Đối với các bệnh lý di truyền, chẩn đoán bệnh ở mức độ phân tử giúp chẩn đoán sớm và chính xác bệnh. Đặc biệt với bệnh thalassemia, một bệnh di truyền trên nhiễm sắc thể thường rất phổ biến ở người Việt Nam, đặc biệt là nhóm người dân tộc thiểu số. Người bệnh có tình trạng thiếu máu, các bệnh lý về xương và ảnh hưởng đến gan, lách, hạch bạch huyết, ngực và cột sống. Bệnh được chia làm ba thể nặng, trung gian và nhẹ. Tuy nhiên thể nhẹ không có biểu hiện trên lâm sàng, đồng thời các phương pháp chẩn đoán thông thường hiện nay như tổng phân tích tế bào máu hay điện di huyết sắc tố chưa phát hiện được các trường hợp người lành mang gen bệnh (như alpha thalassemia dị hợp tử). Việc phát hiện người lành mang bệnh rất quan trọng và là hướng tiếp cận hiệu quả nhất
cho dự phòng thalassmia tại Việt Nam. Do đó ứng dụng các phương pháp sinh học phân tử phát hiện đột biến gen thalassemia là rấtcần thiết cho chẩn đoán và tư vấn các vấn đề di truyền trước khi sinh.
Khi tiến hành xác định đột biến gen, khâu tách chiết DNA được thực hiện đầu tiên và là một bước khá quan trọng quyết định sự chính xác của xét nghiệm. Chất lượng DNA có ảnh hưởng trực tiếp tới kết quả của các kỹ thuật sinh học phân tử. Yêu cầu của DNA tách chiết đạt tiêu chuẩn là: tinh khiết và không đứt gãy; đảm bảo cho kết quả PCR và giải trình tự gen đạt độ chính xác cao.Trong nghiên cứu này, DNA được tách chiết bằng Kit thương mại của hãng QIAGEN, Đức theo quy trình tách cột. Kết quả tách chiết bằng phuong pháp này tại bảng 3.1 cho thấy giá trị về hàm lượng và độ tinh sạch đều của các mẫu là rất ổn định. Tỉ số A260/A280 nằm trong khoảng 1.8÷2.0 cho thấyDNA tách được không bị tạp nhiễm. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm (A260) của các mẫu DNA cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch. Hàm lượng DNA thu được đều trên 200 ng/µl, đảm bảo đủ hàm lượng để tiến hành kỹ thuật multiplex PCR.
Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm multiplex PCR (quy trình beta 1)
Trong đó:
Mẫu (1) (4) (6) (9) (10) DNA bệnh nhân dị hợp tử CD41/42 (ứng với kích thước sản phẩm DNA là 443 bp)
Mẫu (2) (8) là mẫu DNA bệnh nhân đồng hợp tử CD41/42 và CD 17 (ứng với kích thước sản phẩm DNA là 240 bp)
Mẫu (3) (7) là mẫu DNA bệnh nhân dị hợp tử CD17
Mẫu (5) là mẫu DNA chưa xác định đột biến ở quy trình beta 1
Các mẫu bệnh nhân đều lên tốt, kích thước phù hợp với các đột biến của mồi tương ứng đã thiết kế.
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm multiplex PCR (quy trình beta 2)
Trong đó
Mẫu(5) (7) (10) là dị hợp tử HbE ứng với kích thước 502 bp. Mẫu (6) (8) (9) âm tính với Cd26 và IVS1-1
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm multiplex PCR (quy trình alpha)
Trong đó:
Mẫu (1) là dị hợp tử -a3.7
Mẫu (2) (3) (5) (6) (8) âm tính với 5 đột biến thông thường Mẫu (4) (7) (9) (10) (11) là dị hợp tử --SEA
Ngoại trừ mẫu 6, sản phẩm điện di DNA của các mẫu khác đều lên rõ, kích thước phù hợp với kích thước mồi đã được thiết kế.
Kết quả điện di cho thấy chất lượng mồi lên tốt, các band sáng rõ và tương ứng với kích thước dự kiến khi đối chiếu trên maker. Các trình tự mồi và thiết kế được chuyển giao từ Viện Huyết học và Truyền máu. Đây cũng là các thiết kế đã được chuẩn hoá và dùng thường quy trong xác định đột biến gen Thhalassemia tại Viện Huyết học. Do vậy, dù chưa có điều kiện kiểm tra tính đặc hiệu bằng phương pháp giải trình tự gen, đây là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán bệnh nhân đột biến β-thalassemia, nhưng tất cả các trường hợp bệnh nhân
có chẩn đoán thalassemia chúng tôi đều phát hiện tối thiểu 1 đột biến bằng panel sàng lọc này.
Về thiết kế mồi, trong nghiên cứu này, phương pháp multiplex ARMS - PCR đã được áp dụng. Việc sử dụng các cặp mồi để sàng lọc được nhiều loại đột biến đồng thời là rất thuận tiện, nó giúp giảm số lượt thực hiện xét nghiệm do đó tiết kiệm được công sức cũng như tiết kiệm thời gian, vật liệu thực hiện xét nghiệm. Thông thường quy trình xét nghiệm PCR thường kéo dài từ 4-6h đồng hồ, thêm vào đó thalassemia có phân loại phức tạp và đa dạng cac loại đột biến. Nếu thực hiện PCR thường sẽ mất rất nhiều lần sàng lọc cho đến khi tìm được đột biến mới dừng lại.
Khi thực hiện phản ứng multiplex PCR với các bệnh nhân biết trước đột biến thì sản phẩm điện di kết quả tìm được có kích thước phù hợp với kích thước của đột biến từ đó cho thấy phương pháp này có độ đặc hiệu rất cao hoàn toàn có thể áp dụng thường quy tại labo.
Thêm vào đó việc chạy các cặp mồi cho wildtype cùng với các cặp mồi xác định đột biến sẽ giúp multiplex ARMSPCR bớt đi một bước là kiểm tra tình trạng đồng hợp tử trên các bệnh nhân chỉ lên 1 band đột biến.
3.3. Đặc điểm đột biến gây bệnh Thalassemia tại Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên Thái Nguyên
Bảng 3.1. Phân bố kiểu gen đột biến trên các bệnh nhân - Thalassemia Đồng hợp/
dị hợp Kiểu hình Kiểu gen Số lượng Tỷ lệ % Đồng hợp tử (n= 12) 0/0 17/17 3 7.0 41/42/41/42 8 18.6 71/72/71/72 1 2.3 Dị hợp tử kép (n= 27) 0/0 17/41/42 5 11.6 71/72/IVS1.1 1 2.3 41/42/IVS1.1 2 4.7 0/+ 17/cd26 8 18.6 41/42/cd26 6 14.0 71/72/cd26 2 4.7 41/42/-90 1 2.3 -28/IVS2.654 1 2.3 Dị hợp tử đơn (n=5) 0/ 41/42/ 2 4.7 71/72/ 1 2.3 +/ cd26/ 1 2.3 -28/ 1 2.3 Tổng 43 100
Tống số 43 bệnh nhân beta thalassemia đều phát hiện thấy ít nhất một đột biến gen bằng quy trình AMMS-PCR, trong đó 5 trường hợp mang kiểu gen dị hợp tử đơn (11,6%), 12 trường hợp mang kiểu gen đồng hợp tử (27,9%) và 26 trường hợp có kiểu gen dị hợp tử kép (60,5%). Trong số dị hợp tử kép, 16 trường hợp có sự phối hợp một đột biến - thalassemia với HbE (37,2%).
Bảng 3.2. Đặc điểm phân bố alen đột biến trên các bệnh nhân
Kiểu hình Alen đột biến Số lượng Tỷ lệ %
0- Thalassemia cd 41/42 (-TTCT) 32 37,1 cd17 (A T) 19 22,1 cd 71/72 (+A) 6 7,0 IVS 1.1 (G T) 3 3,5 +- Thalassemia cd 26 (GA) HbE 17 19,8 -28 (A G) 2 2,3 - 90 (C T) 1 1,2 IVS 2.654 (C T) 1 1,2
Không phát hiện đột biến đơn alen 5 5,8
Tổng 86 100
Trong 86 alen của 43 bệnh nhân β - thalassemia, có7 loại đột biến trong 8 loại alen đột biến được phát hiện trên panel sàng lọc tại labo BV TƯTN.Bao gồm:
- 4 đột biến thuộc nhóm 0thalassemia (cd17, IVS 1.1, cd 41/42, cd71/72) và 3 đột biến thuộc nhóm + thalassemia (cd26 (HbE), nt-28, IVS 2.654.
- 1 đột biến cd -90 ngoài panel sàng lọc nhưng được gửi lên tuyến trên kiểm tra loại đột biến.
Trong số các alen đột biến, alen gây biến đổi cấu trúc phân tử hemoglobin cd 41/42 (-TTCT) chiếm tỷ lệ cao nhất (37,1%), kế tiếp là các alen cd17 (A
T) (22,1%) và HbE-cd26 (19,8%).
Bước đầu áp dụng kỹ thuật ARMS PCR cho 58 trường hợp bệnh nhân điều trịthalassemia tại Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên, chúng tôi phát hiện được 43 trường hợp có đột biến beta thalassemia và 15 trường hợp đột biến alpha thalassemia.
Với beta thalassemia, 15 kiểu tổ hợp gen biểuhiện ra ở 3 nhóm kiểu hình trong đó chiếm tỷ lệ cao nhất là dị hợp tử kép (60,5%) tiếp đến là nhóm đồng hợp tử (27,9%) và dị hợp tử đơn chiếm (11,6%).Trong số các kiểu gen, kiểu đồng hợp tử41/42/41/42 và dị hợp tử kép 17/cd26 hay - thalassemia- HbE chiếm tỷ lệ cao nhất (18,6%). Điều này là phù hợp với tình trạng mang gen trong khu vực. Theo nghiên cứu của Nguyễn Kiều Giang và cộng sự cho thấy tần xuất đột biến của alen CD41/42, CD17 và CD26 đứng đầu trong nhóm đột biến gây - thalassemia tại khu vực Thái Nguyên [28]. Nghiên cứu khác trong nhóm quần thể tại Việt Nam cũng cho thấy tần xuất CD41/42 đứng đầu với tỷ lệ 35%, tiếp đến là CD17 chiếm (25%) [40]. Nghiên cứu của chúng tôi áp dụng kỹ thuật multiplex ARMS PCR cho 9 loại đột biến thông thường và phát hiện được tối thiểu 1 đột biến gen trong tất cả các trường hợp. Tuy nhiên có 1 trường hợp chúng tôi chỉ phát hiện được 1 kiểu đột biến đơn alen là cd41/42 nhưng kiểu hình trên lâm sàng, huyết đồ và điện di không tương xứng với tình trạng dị hợp tử đơn. Trường hợp này được gửi đi làm giải trình tự gen với kết quả xác định được 2 đột biến là CD-90 . Đây là đột biến hiếm gặp trong cộng đồng người Việt Nam và thuộc nhóm + thalassemia, tuy nhiên khi phối hợp với các đột biến 0, + hoặc E đều gây lên hội chứng thalassemia. Kết quả này cho thấy sự hiện diện của các đột biến hiếm và gợi ý cho việc thiết lập thêm bộ mồi cho các đột biến này để sẵn sàng chẩn đoán các trường hợp hiếm gặp bằng kỹ thuật PCR khi chưa được trang bị thêm các phương tiện chẩn đoán khác.
Trong 86 alen được khảo sát, alen đột biến CD41/42 chiếm tỷ lệ cao nhất (37,1%) tiếp đến là CD17 (22,1%), các loại đột biến khác chiếm tỷ lệ ít hơn. Có 17 bệnh nhân (19,8 %) được phát hiện mang gen đột biến CD26 (HbE) và các trường hợp này kết hợp với gen β0 hoặc β+ tạo nên bệnh β thalassemia/HbE và các trường hợp β0/βE đều thể hiện tình trạng thiếu máu nặng trên huyết đồ. Kiểu alen CD95 (+A) được phát hiện trong một số nghiên cứu trước đó được xem như là loại đột biến của người Việt Nam. Bạch Quốc Khánh và cộng sự khi nghiên cứu trên 324 bệnh nhân beta thalassemia/HbE cho thấy tỷ lệ kết hợp CD95-CD26
(HbE) là 1,9% còn trong nghiên cứu của Nguyễn Thuỳ Trang là 0,7%[41], [42]. Tuy nhiên trong nghiên cứu này chúng tôi không phát hiện trường hợp nào mang alen đột biến tại CD95. Có thể do sự phân bố dân tộc trong nhóm bệnh nhân thalassemia tại đây hầu hết là người dân tộc thiểu số trong khi CD95 (+A) chủ yếu được phát hiện trong nhóm người Kinh [40], [ 43].
Bảng 3.3. Phân bố kiểu gen và giá trị trung bình các chỉ số huyết học
Kiểu hình Kiểu gen
Giá trị trung bình các chỉ số huyết học RBC (x1012/l Hb (mg/l) MCV MCH RDW 0/0 (đồng hợp tử) 17/17 2,3 ± 0,7 Max:3,2 Min:1,3 55,5 ±16,8 Max: 91 Min:32 79 ± 5,6 Max:88,6 Min: 68,2 24,9 ± 2,45 Max: 29 Min: 22 19,2 ± 4,6 Max:27,6 Min: 4,6 41/42/41/42 71/72/71/72 0/0 (dị hợp tử kép) 17/41/42 2,8 ± 1,0 Max:4,3 Min: 1,6 61,8 ± 18,7 Max: 97 Min: 38 76,5 ± 9,3 Max:94,1 Min: 55 22,5 ± 2,7 Max:26,9 Min: 14,8 23,3 ± 6,1 Max:37,7 Min: 15,7 17/IVS1.1 41/42/IVS1.1 0/+ (dị hợp tử kép) 17/cd26 3,2 ± 0,6 Max: 4,2 Min: 2,3 64,3 ± 15,4 Max: 95 Min: 44 69,2 ± 7,9 Max: 79,5 Min: 56,5 20,2 ± 3,1 Max: 26 Min: 15,5 25,5 ± 2,7 Max: 29,1 Min: 19,7 421/42/cd26 71/72/cd26 -28/IVS2.654 0/ +/ (dị hợp tử đơn) 17/ 3,6 ± 1,1 Max: 4,8 Min: 2,5 81,8 ± 13,5 Max: 94 Min: 66 74,9 ± 9,9 Max:86,7 Min: 63,9 23,3 ± 3,4 Max: 26,6 Min: 19,2 17,6 ± 3,6 Max: 23,0 Min: 15,4 41/42/ 71/72/ cd26/
Các chỉ số hồng cầu có sự thay đổi liên quan đến kiểu gen đột biến.Tình trạng thiếu máu nặng được thể hiện ở các kiểu gen có sự góp mặt của các kiểu đột biến gây tình trạng β0 như đồng hợp tử β0, dị hợp tử kép β0/β0, β0/β+,β0/βE.
Các chỉ số về huyết đồ trước khi truyền máu được xem xét trong mối tương quan với kiểu gen đột biến bao gồm số lượng hồng cầu (Rbc), huyết sắc
tố (Hb), thể tích trung bình hồng cầu (MCV), huyết sắc tố trung bình hồng cầu (MCH) và phân phối rộng của hồng cầu (RDW). Giá trị trung bình của các chỉ số này được thể hiện ở Bảng 3.3. So với giá trị tham chiếu của WHO (2011) dựa trên Hb thì các chỉ số về máu của bệnh nhân huyết tán cho thấy tình trạng thiếu máu nặng với đặc điểm hồng cầu nhỏ nhược sắc. Hầu hết tình trạng thiếu máu nặng được thể hiện ở các kiểu gen có sự góp mặt của các kiểu đột biến dẫn