3. Ý nghĩa của luận văn
2.5.5. Phương pháp thiết kế vector tách dòng promoter
Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch được gắn vào vector tách dòng pDONR201 bằng phương pháp Gateway sử dụng enzyme BP clonase. Các bước tiến hành như sau:
- Thành phần phản ứng + DNA (10ng/ul): 2 µl + Vector (75ng/ul): 1 µl + BP clonase enzyme: 1 µl Tổng số: 4 µl - Ủ ở nhiệt độ phòng 1hr
- Bổ sung 0,5ul proteinase K, ủ ở 37oC trong 10 phút - Biến nạp vào E.coliDH5α.
Hình 2.1. Sơ đồ miêu tả phản ứng BP ghép nối gene và vector tách dòng 2.5.6. Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến
Sản phẩm ghép nối được biến nạp vào tế bào E.coliDH5α. theo phương pháp shock nhiệt ở 42oC.
- Lấy tế bào khả biến từ tủ lưu giữ -80oC đặt trên đá - Trộn 2 µl DNA vào 100 µl E.coliDH5α.
- Đặt trên đá 30 phút
- Shock nhiệt ở 42oC trong 40s
- Bổ sung 900 µl môi trường LB lỏng - Nuôi lắc ở 37oC trong 1h
- Cấy trải 100 µl dung dịch nuôi lắc trên đĩa môi trường LB đặc có kháng sinh chọn lọc kanamycin.
- Nuôi qua đêm ở 37oC.
2.5.7. Phương pháp sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp
Để sàng lọc dòng tế bào mang vector tái tổ hợp chúng tôi sử dụng phương pháp PCR các khuẩn lạc. Lựa chọn ngẫu nhiên 3 khuẩn lạc có kích thước đồng đều sau khi nuôi qua đêm ở 37oC tiến hành PCR với cặp mồi đặc hiệu. Phương
pháp và thành phần phản ứng tương tự ở bảng 2.2, trong đó sử dụng enzyme Taq
DNA polymesase và khuẩn lạc cho phản ứng. Phản ứng được thực hiện ở 30-35 chu kỳ. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8% và đọc kết quả dựa trên thang marker chuẩn 1kb. Lựa chọn khuẩn lạc có kích thước đúng để tiến hành các bước tiếp theo.
2.5.8. Phương pháp tách chiết plasmid
Khuẩn lạc lựa chọn được nuôi qua đêm ở 36oC, 200v/phút trên môi trường LB đặc (10g Bacto-tryptone, 5g yeast extract, 10g NaCl, 15g agar) có bổ sung 100mg/l kháng sinh kanamycin để chọn lọc tế bào tái tổ hợp. Tiến hành nuôi tăng sinh trong môi trường LB lỏng và thu tế bào để tách plasmid.
Bảng 2.3. Thành phần hóa chất tách chiết plasmid
STT Thành phần
Sol I 50 mM glucose, 25 mM Tris HCl pH 8, 10 mM EDTA pH 8 Sol II 0,2 M NaOH, SDS 1 %
Sol III 60 ml potassium acetate 5M; 11,5 ml glacial acetic acid; 28,5 ml H2O
Các bước tiến hành tách plasmid:
- Lấy 1ml dung dịch vi khuẩn nuôi trong LB lỏng.
-Ly tâm 7000 vòng/phút thu tế bào, có thể lặp lại 5 lần để thu hết cặn khuẩn của dịch khuẩn.
-Bổ sung 100 µl Sol I, voltex dịch.
-Bổ sung 200 µl Sol II trộn nhẹ trong 30 giây.
-Bổ sung tiếp 1500 µl Sol III trộn nhẹ trong 30 giây.
-Bổ sung 500 µl chloroform : isoamin (24 : 1) trộn đều trong 3 phút.
-Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch nổi 400 µl trên sang ống eppendorf mới.
-Cho 400 µl isopropanol 100% để ở nhiệt độ -20oC trong 30 phút, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, loại bỏ phần dịch lỏng, thu cặn.
-Cho 500 µl cồn 70% vào, ly tâm 12000 v/p trong 5 phút, sau đó loại bỏ cồn, làm lại hai lần.
- Làm khô mẫu trong box 30 phút.
-Hòa tan sản phẩm trong 50 µl nước khử ion. -Bổ sung RNase
-Ủ ở 370C trong 30 phút.
-Kiểm tra sản phẩm tách plasmid bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
2.5.9. Phương pháp định lượng DNA
Trước khi tiến hành các thí nghiệm, DNA plasmid được kiểm tra nồng độ bằng máy quang phổ hấp phụ và điện di trên gel agarose 0,8%.
Các đoạn DNA có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương trong cùng điện trường có điện thế và cường độ thích hợp.
Cách tiến hành
-Cân 1g agarose pha trong 100ml dung dịch đệm TAE 0,5X
-Đun nóng dung dịch trong lò vi sóng từ 1-2 phút cho đến khi agarose tan hoàn toàn sau đó để nguội khoảng 50oC.
-Đặt khay đổ gel trên bề mặt phẳng, lắp khay điện di vào khay đổ gel. -Dùng pipet 1ml hút agarose và trải dọc theo phần thanh chắn nhằm tránh rò rỉ gel khi đổ. Tiến hành đổ phần gel còn lại từ từ, liên tục để tránh lẫn bọt, cắm lược và để yên cho gel đông lại.
-Khi gel đã đông, cẩn thận nhấc thanh chắn và đặt gel vào bể điện di theo đúng chiều (-) đến (+), đổ dung dịch đệm TAE 0,5X ngập bản gel rồi nhấc lược ra khỏi bản gel.
-Gắn bể điện di với bộ nguồn, trộn mẫu với Loading Dye 6X theo tỷ lệ (7µl mẫu : 3µl Loading Dye) và tra mẫu vào giếng. Lưu ý, tra nhẹ nhàng, tránh làm vỡ giếng gel.
-Đậy nắp máy điện di, cắm điện, bật công tắc máy điện di. Điện di với dòng điện 110V trong thời gian 30 phút.
-Khi máy đã chạy hết thời gian cài đặt hoặc quan sát độ di chuyển của thuốc nhuộm trên gel để dừng quá trình điện di, tắt công tắc nguồn.
-Mở nắp buồng điện di, lấy bản gel ra và ngâm trong dung dịch EtBr khoảng 5 phút.
-Lấy bản gel ra đem tráng nhẹ trong nước (tránh nước xả trực tiếp vào bản gel) rồi đưa lên máy soi UV quan sát và chụp ảnh.
2.5.10. Phương pháp xác định trình tự
Để kiểm tra hiệu quả tách dòng RMP promoter, chúng tôi gửi giải trình tự gen. Trình tự gen được kiểm tra bằng các phần mềm Bioedit, NCBI/Blast….
2.5.11. Thiết kế vector biểu hiện GUS
Promoter RMP sau khi tách dòng thành công sẽ được chuyển vào vector biểu hiện pKGWFS7 có chứa gen chỉ thị GFP/GUS sử dụng enzyme LR clonase. Toàn bộ phản LR được thực hiện theo hướng dẫn của hãng Invitrogene. Trình tự promoter sẽ được chèn vào vùng ccdB, giới hạn bởi hai đầu attR1 và attR2 bằng phương pháp Gateway. Các bước tiến hành như sau:
- Thành phần phản ứng: + pDOR201-RMP (25ng/ul): 1 µl + pKGWFS7 (50ng/ul): 1 µl + LR clonase enzyme: 1 µl + Nước cất khử ion: 1 µl Tổng số: 4 µl -Ủ ở nhiệt độ phòng 1hr
-Biến nạp vào E.coliDH5α.
-
Hình 2.2. Sơ đồ miêu tả phân tử DNA tham gia vào phản ứng LR
Sản phẩm phản ứng được biến nạp vào tế bào E.coliDH5α bằng phương pháp shock nhiệt và sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp bằng PCR với cặp mồi đặt hiệu (như trình bày ở mục trên). Tế bào E.coliDH5α tái tổ hợp được tách plasmid và biến nạp vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chủng GV3101 bằng phương pháp sốc nhiệt ở 37oC để sử dụng cho chuyển gen.
- Phân tích yếu tố CRE và thiết kế vector chuyển gen
Trình tự promoter được scan bằng phần mềm PLACE (https://www.hsls.pitt.edu/obrc/index.php?page=URL1100876009) để xác định các CRE có mặt trên vùng promoter. Tiếp đến vùng promoter được khuếch đại bằng PCR.
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kít sau đó được cắt thành từng phần có độ dài khoảng 300-500 bp bằng enzyme. Các đoạn promoter sau đó gắn với gen
chỉ thị GUS (Hình 2.3). Promoter được đưa vào vector nhân dòng pDONR201 trong E.coliDH5a sau đó được kiểm tra bằng PCR và giải trình tự gen. Promoter sau đó được chuyển sang vector chuyển gen pKGWFS7 bằng phương pháp Getway và chuyển vào trong cây Arabidopsis bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens GV3101.
Hình 2.3. Phương pháp cắt phân đoạn promoter để phân tích CRE 2.5.12. Phương pháp biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
- Lấy tế bào khả biến vi khuẩn Agrobacterium chủng GV3101 từ tủ lưu giữ -80oC.
- Trộn 4 µl DNA plasmid với 100 ul tế bào khả biến. Nhúng nhanh vào Nitơ lỏng.
- Chuyển sang 37oC trong 5 phút.
- Bổ sung 900 µl LB lỏng, nuôi lắc ở 28oC, 200 vong/phút, 4hr.
- Cấy trải 100 µl dung dịch trên đĩa môi trường LB có kháng sinh chọn lọc. - Nuôi ở 28oC từ 3 - 4 ngày.
- Sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp bằng phương pháp PCR.
2.5.13. Phương pháp chuyển gene trên cây Arabidopsis
Phương pháp được tiến hành theo Clough (1998) [19].
2.5.13.1. Tạo dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium: dung dịch chứa Agrobacterium (5% sucrose và 500 µl /lit chất hoạt động bề mặt Slwet L-77). Sucrose và chất hoạt động bề mặt rất quan trọng đối với sự thành công của phương pháp nhúng hoa.
- Lấy chủng khuẩn từ tủ lưu giữ và cấy vạch lên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin 100mg/l đối với chủng A.tumerfaciens
mang vector chuyển gen, nuôi trong tủ ổn nhiệt 28ºC trong thời gian 48 giờ. - Lấy một khuẩn lạc riêng biệt phát triển tốt trên đĩa khuẩn và cấy vào 10ml LB lỏng có bổ sung các loại kháng sinh chọn kanamycin 50mg/l. Bình nuôi lỏng được đặt trong máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút ở nhiệt độ 28ºC nuôi qua đêm. Hút 1ml dịch khuẩn cho vào 50 ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh, nuôi qua đêm (16 - 20 giờ) nuôi lắc 200 vong/phút trong điều kiện 28oC. Dịch khuẩn thu được có OD 260nm từ 0,7-1 là đủ điều kiện để biến nạp.
2.5.13.2. Biến nạp gen
Nhúng toàn bộ cụm hoa của cây Arabidopsis vào trong môi trường có chứa vi khuẩn trong 30 giây. Cây chuyển gene được tiếp tục nuôi trong điều kiện 25oC 18h chiếu sáng/ngày đến khi thu hoạch quả.
2.5.13.3. Chọn lọc cây chuyển gen
Hạt thu từ cây chuyển gen được chọn lọc trên môi trường kháng sinh kanamycin 50mg/l. Cây chuyển gene kháng kháng sinh được chuyển ra trồng và phân tích.
2.5.14. Phương pháp đánh giá hoạt động của promoter
Phân tích biểu hiện gen chỉ thị GUS ở cụm hoa. Gen gus A. Gen mã hóa cho sinh tổng hợp enzyme β-glucuronidase. β-glucuronidase là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải các β-glucuronide, sản phẩm phân giải có màu xanh chàm đặc trưng, dễ nhận biết. β-glucuronide thường dùng nhất trong phản ứng để nhận biết sự tồn tại của gen gus A là X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β- D-glucuronide). Dung dịch X-Gluc không màu dưới tác động của enzyme β- glucuronidase sẽ chuyển sang màu xanh chàm [9].
Khả năng hoạt động của promoter được đánh giá dựa trên biểu hiện của gen chỉ thị GUS sau khi nhuộm bằng X- Gluc theo phương pháp của Jefferson (1987).
1. Ngâm mô trong dung dịch nhuộm. Ống microfuge hoạt động tốt cho các mẫu mô nhỏ, nắp ống màu cam hoạt động tốt hơn cho các mẫu mô lớn hơn.
2. Hút chân không thâm nhập nhanh. 3. Ủ mô qua đêm ở 37oC.
4. Loại bỏ dung dịch nhuộm và diệp lục: rửa vài lần 50% ethanol đến khi nhận rõ màu xanh lam đặc trưng . Ủ khoảng 12 giờ giữa mỗi thay đổi 50% ethanol [33].
Sự có mặt của gen GUS được kiểm tra bằng PCR DNA tổng số được tách từ hạt phấn của 14 cây chuyển gen T1 sử dụng kít DNA Plant Mini Kit (QIAGEN, Đức) với cặp mồi đặc hiệu: GUS-F:
5’- TTCGATAACGTGCTGATGG-3’ và GUS-R: 5’- AATAACGGTTCAGGCACAGCACA-3’.
PCR theo chu trình nhiệt 94oC/2 phút, 30 chu kỳ (94o C/15 giây, 55o C/ 15 giây, 72o C/1 phút), 72o C/10 phút. Sản phẩm PCR được kiểm tra điện di trên gel agarose 2%.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân tích trình tự promoter để sàng lọc các yếu tố CRE
Trình tự promoter RMP được phân tích dựa trên phần mềm dự đoán Plant
Cis-acting Regulator DNA elements (PLACE) (Higo và cs. 1999). Dựa trên kết quả phân tích, vị trí của các yếu tố CRE sẽ được đánh dấu trên trình tự của promoter (phụ lục 1). Kết quả cho thấy có rất nhiều yếu tố CRE được phát hiện trên vùng promoter RMP. Các CRE có vai trò và chức năng khác nhau được chia thành các nhóm chức năng (Bảng 3.1 và 3.2). Trong đó có rất nhiều CRE xuất hiện phổ biến trên tất cả các vùng promoter (Bảng 3.1). Trong đó, sáu CRE phổ biến nhất như ACGTATERD1, ARR1AT, CAATBOX1, GATABOX, MYBCORE và DOFCOREZM. Tần số xuất hiện của các CRE được thể hiện ở biểu đồ hình 3.1. Trong các promoter, yếu tố ACGTATERD1 xuất hiện với 16 lần trên vùng promoter RMP5, 12 lần trên RMP1 và RMP3, 8 lần trên RMP 2, RMP4 và RMP8 và 4 lần trên RM9, RMP10. ARR1AT xuất hiện 26 lần trên RMP2, 24 lần trên RMP3, 22 lần trên RMP10, RMP5 (21), RMP9 (18), RMP6 (14), RMP7 (13), RMP1 (12), RMP4 (4). Hộp CAATBOX1 xuất hiện 34 lần trên RMP2, 22 lần trên RMP3, RMP10, RMP1 (18), RMP 5 (16), RMP7 (16), RMP9 (12), RMP6 (11), RMP8 (7), RMP4 (5). Hộp GATA xuất hiện 30 lần trên RMP1, RMP5 (20), các RMP6, 7,9 và RMP10 xuất hiện từ 15 đến 17 lần. Yếu tố MYBCORE xuất hiện 10 lần trên promoter RMP5, 6 lần trên RMP3, 4 và RMP10, 4 lần trên RMP1, RMP2 và RMP8. Yếu tố DOFCOREZM xuất hiện từ 31 đến 56 lần trên RMP2, RMP5, RMP6 và RMP10, từ 10 đến 25 lần trên RMP3, RMP4, RMP8, RMP9.
Ngoài các CRE xuất hiện với tần số lớn nêu trên, kết quả phân tích phát hiện 11 CRE liên quan đến tính biểu hiện chuyên biệt ở mô, cơ quan (Bảng 3.2). Trong đó, một số CRE chuyên biệt hạt phấn như GTGANTG10, POLLEN1LELAT52,
SITEIIATCYTC, 5659BOXLELAT5659. Promoter RMP1, RMP2 và RMP3 có từ 10 đến 17 trình tự GTGANTG10, các promoter khác từ 5 đến 8 trình tự. Tương tự, yếu tố POLLEN1LELAT52 xuất hiện với tần số từ 13 đến 15 lần trên RMP2, RMP5, RMP6 và RMP10. Các CRE SITEIIATCYTC, 5659BOXLELAT5659 chỉ thấy xuất hiện trên RMP4, RMP8 và RMP10 (hình 3.2). Để đánh giá vai trò của CRE đối với khả năng hoạt động của promoter, chúng tôi lựa chọn gen RMP1 để tiến hành phân tích chi tiết.
Bảng 3.1. Các yếu tố CRE phổ biến trên promoter RMP
Yếu tố CREs Trình tự (5’-3’) Chức năng Tài liệu tham khảo
ACGTATERD1 ACGT Tham gia quá trình chống chịu hạn và già hóa tế bào của gen
erd1 Simpson và cs. 2003
ARR1AT NGATT (N=G/A/C/T) Yếu tố phiên mã tham gia quá trình tổng hợp cytokinin Ross và cs. 2004 CAATBOX1 CAAT Tham gia điều khiển promoter biểu hiện chuyên biệt mô, cơ
quan. Shirsat và cs. 1989
CURECORECR GTAC Tham gia quá trình tổng hợp ion đồng Kropat và cs. 2005
DOFCOREZM AAAG Tham gia sinh tổng hợp các bon Yanagisawa 2000
GATABOX GATA Hộp GATA chuyên biệt cho biểu hiện mô Reyes và cs. 2004
GT1CONSENSUS GRWAAW (R=A/G;
W=A/T) GT-1 liên kết các gen tham gia điều khiển ánh sáng Villain và cs. 1996 MYBCORE CNGTTR Yếu tố phiên mã MYB tham gia biểu hiện chuyên biệt hạt
phấn Solano và cs. 1995
MYCCONSENSUSAT CANNTG (N=A/T/G/C) MYC tham gia quá trình chống chịu stress phi sinh học Oh và cs. 2005 WRKY71OS TGAC WRKY tham gia quá trình tổng hợp giberrelin Zhang và cs. 2011
Bảng 3.2. Các yếu tố CRE chuyên biệt mô trên promoter RMP
Yếu tố CREs Trình tự (5’-3’) Chức năng Tài liệu tham khảo
AACACOREOSGLUB1 AACAAAC Mô típ ACGT và AACA tham gia biểu hiện chuyên biệt
nội nhũ hạt Wu và cs. 2000
CACTFTPPCA1 YACT (Y=T/C) Tham gia biểu hiện chuyên biệt ở biểu bì mô. Gowik và cs. 2004
EBOXBNNAPA CANNTG
(N=A/G/C/T) Yếu tố RRE tham gia tổng hợp phenylpropanoids ở mô Stålberg và cs. 1996 GTGANTG10 GTGA Biểu hiện chuyên biệt hạt phấn giai đoạn trưởng thành ở
cây thuốc lá Rogers và cs. 2001
POLLEN1LELAT52 AGAAA Tăng cường biểu hiện chuyên biệt ở hạt phấn Filichkin và cs. 2004
P1BS GNATATNC Kiểm soát các gen biểu hiện ở rễ Schünmann và cs.
2004
OSE1ROOTNODULE AAAGAT Mô típ OSE biểu hiện rễ Fehlberg và cs. 2005
RHERPATEXPA7 KCACGW
(K=G/T; W= A/T) Biểu hiện chuyên biệt ở rễ Kim và cs. 2006 ROOTMOTIFTAPOX1 ATATT Biểu hiện chuyên biệt ở rễ ở cây thuốc lá Elmayan và Tepfer
1995
RYREPEATBNNAPA CATGCA Biểu hiện chuyên biệt ở hạt Ezcurra và cs. 1999 TAAAGSTKST1 TAAAG Biểu hiện chuyên biệt thành tế bào Plesch và cs. 2001 SITEIIATCYTC GNATATNC Biểu hiện chuyên biệt hạt phấn và đỉnh sinh trường Welchen and
Gonzalez 2005 5659BOXLELAT5659 GAAWTTGTGA
Hình 3.1. Tần số xuất hiện của các yếu tố CRE phổ biến trên promoter RMP
3.2. Biểu hiện của gen RMP1 ở hạt phấn
Kết quả phân tích database (RiceXPro) ở các giai đoạn từ khi hình thành hoa mầm hoa (inflorescence) đến hình thành vỏ hạt (lemma, palae) cho thấy gen
RMP1 bắt đầu biểu hiện khi bao phấn (anther) được hình thành. Gen biểu hiện mạnh nhất ở giai đoạn bao phấn có kích thước từ 1.5 đến 2.0mm (hình 3.3),