3.1.1. Nguyên vật liệu
- Nấm men bia Saccharomyces cereviasia được thu nhận từ xưởng bia của Trung tâm sản xuất thực nghiệm&chuyển giao công nghệ – Viện công nghệ thực phẩm.
- Bã nấm men bia thu hồi tại Xưởng bia Viện Công nghiệp thực phẩm.
3.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 3.1.2.1. Hóa chất: 3.1.2.1. Hóa chất:
- K2SO4, NaOH 30%, H2SO4 đậm đặc, CuSO4, HCl, H2SO4 0,1N - Các loại enzyme sử dụng: Neutrase; Alcalase; Flavourzyme
3.1.2.2. Dụng cụ và thiết bị:
- Bể cách thủy Memmert- Đức
- Nồi hấp áp lực TOMMY – Nhật Bản - Máy so màu – Mỹ
- Cân phân tích Pessia – Thụy Sĩ - Cân kỹ thuật – Trung Quốc - Tủ ấm – Trung Quốc - Chiết quang kế – Đức - Máy đo pH – Nhật Bản
- Cân phân tích hàm ẩm – Thụy Sĩ
- Các dụng cụ thí nghiệm đơn giản của phòng thí nghiệm
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford
Trong các phương pháp xác định hàm lượng protein thì đây là phương pháp có độ nhạy cao, có thể xác định tới 1µg.
Nguyên tắc:
- Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brillant Blue tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mang tính axit khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu tím nhạt có bước sống thấp thu cực đại là 465 nm và khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển
24
sang dạng màu xanh dương và hấp thu cực đại ở mức cực đại ở bước sóng 595 nm. Độ hấp thu ở bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp với nồng độ protein. Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết được nồng độ. Sau khi cho dung dịch protein vào thuốc nhuộm màu, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1giờ. Tiến hành đo dung dịch bằng máy quang phổ kế (Spectrophotometer) ta được OD độ hấp thụ sẽ tỷ lệ với lượng protein trong mẫu. Thực hiện một đối chứng với HCl (OD). Lấy giá trị ∆OD = OD
- Lượng protein trong mẫu dung dịch đo được xác định bằng cách dựa vào đường chuẩn từ giá trị OD ở trục tung, từ đó suy ra giá trị nồng độ protein tương ứng trên trục hoành.
Hóa chất:
Dung dịch albumine 0.1%, nước cất.
Dung dịch thuốc thử Bradford: thành phần thuốc thử trong 100 ml như sau:Coomassie Brilliant Blue: 0.001g ; Ethanol tuyệt đối: 4.7 g; Phosphoric axit: 85%
3.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng Nitơ tổng số (theo phương pháp Kjeldahl) Kjeldahl)
Nguyên lý
Vô cơ hóa mẫu bằng H2SO4 đậm đặc và chất xúc tác, sau đó dùng kiềm mạnh (NaOH hay KOH) để đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4 hình thành ra thể tự do. Định lượng NH3 bằng H2SO4 0,1N.
Tiến hành
- Đốt đạm: Cho 1g mẫu, 5g chất xúc tác (K2SO4 và CuSO4) và 10ml H2SO4
đậm đặc vào bình Kjeldahl và đun trên bếp từ từ cho đến khi thu được dung dịch trong suốt không màu hoặc có màu xanh lơ của CuSO4 để nguội.
Chú ý: Quá trình vô cơ hóa mẫu trong bình Kjelhdahl giải phóng khí SO2
nên phải tiến hành trong tử hút.
Trong quá trình đốt nên đặt bình nằm hơi nghiêng trên bếp.
- Cất đạm: Sau khi vô cơ hóa mẫu hoàn toàn, cho một ít nước cất vào bình Kjeldahl để tráng rồi cho vào bình định mức 500ml, tráng rửa bình Kjeldahl và
25
phễu vài lần rồi cho vào bình định mức và cho khoảng 10÷15ml NaOH 40% và vài giọt phenolphtalein vào bình định mức, sau đó thêm nước cất vừa đủ 300ml.
Chuẩn bị dung dịch ở bình hứng NH3: dùng pipet cho vào bình hứng khoảng 10ml axit Boric, sau đó lắp vào hệ thống sao cho đầu ống sinh hàn ngập trong dung dịch axit Boric. Bắt đầu quá trình cất đạm cho đến khi dung dịch trong bình hứng đạt khoảng 150ml.
- Chuẩn độ: Lấy bình hứng ra và đem đi chuẩn độ bằng H2SO4 0,1N. *Tính kết quả
Hàm lượng protein thô = , × ( ’ × × , )
3.2.3. Phân tích độ hòa tan
Sử dụng thiết bị đo Bx đo độ hòa tan của dung dịch chất tan
3.2.4. Đánh giá chất lượng nguyên liệu
Xử lý bã nấm men bia
Nguyên liệu nấm men sau khi đưa về được xác định hàm lượng ẩm rồi đem đi lọc, rây để loại bớt nước trước khi tách đắng. Sau khi rửa bằng nước lạnh (5ᴼC), được ly tâm tách nước, rồi tiến hành phân tích các thành phẩm cơ bản của nấm men ( hàm ẩm, protein, hydratcacbon, hàm lượng đắng,…)
3.2.5. Xác định hàm lượng chất đắng (bằng phương pháp so màu)
Xử lý chất đắng của nấm men sau khi thủy phân
Nguyên liệu nấm men đưa về được rửa với nước rửa có giá trị pH khác nhau ở nhiệt độ lạnh (5ᴼC). Quá trình rửa nấm men được lặp lại nhiều lần. Sau đó đem ly tâm tách nước. Nấm men thu được sau mỗi lần rửa được tiến hành phân tích hàm lượng đắng.
a/ Nguyên tắc:
Chất đắng có trong bia hoặc trong nấm men bia do -axit đắng tạo thành từ hoa houblon.
Chiết chất đắng ra khỏi bia hoặc nấm men bia bằng dung môi hữu cơ (Iso-octan), đo độ hấp phụ ở bước sóng 275nm
b/Cách tiến hành:
Cân 3-5 gam mẫu (tùy theo từng loại mẫu) cho vào ống ly tâm dung tích 50ml, sau đó them 20ml dung môi Iso-octan. Lắc đều 10 phút. Tiến hành ly tâm 10
26
phút ở tốc độ 4000 vòng/phút, rồi lọc qua giấy lọc. Lấy phần dung dịch đã lọc đem đo ở bước sóng 275nm. Làm mẫu trắng tương tự, chỉ thay mẫu bằng nước cất.
c/ Cách tính: Độ đắng= ((A₁ - A₂) x 50)/m
Trong đó : A1: giá trị đo của mẫu thí nghiệm ở bước sóng 275nm A2 : Giá trị đo của mẫu trắng ở bước sóng 275nm m: Trọng lượng mẫu phân tích (g)
50: Hệ số chuyển đổi Iso- octan sang chất đắng
3.2.6. Xác định pH của bã nấm men bằng máy đo pH
Sử dụng máy đo pH để xác định pH của bã nấm men bia.
3.2.7. Phân tích độ ẩm nấm men
Nấm men sau khi rửa và ly tâm được xác định độ ẩm bằng máy cân hàm ẩm của Thủy Sĩ theo nguyên lý xác định trọng lượng không đổi sau quá trình sấy 105oC.
3.2.8. Phương pháp xác định nồng độ protein tổng
* Nguyên tắc: Dựa trên cơ sở phản ứng tạo mầu giữa protein với dung dịch mầu huyết thanh bò (Bovine Serum Albumin - BSA). Cường độ mầu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định. Biết được mật độ quang của dung dịch protein nghiên cứu với dung dịch mầu BSA từ đó dựa theo đường chuẩn của protein tinh khiết với thuốc thử này, tính được hàm lượng protein nghiên cứu.
* Tiến hành:
Hàm lượng protein đã được xác định bằng phương pháp của Bradford (1976). Hỗn hợp phản ứng bao gồm: 100l của enzym và 900l dung dịch Bradford, lắc đều, để sau 5 phút thì đem đo ở bước sóng 595nm bằng máy so mầu điện quang.
Nồng độ protein có trong mẫu được tính toán dựa trên phương trình đường chuẩn BSA - Bradford.
Đường chuẩn BSA - Bradford được xác định bằng cách sử dụng và pha loãng dung dịch BSA theo các nồng độ khác nhau, sau đó tiến hành làm phản ứng giống như làm với các mẫu.
3.2.9. Phương pháp xác định axit amin tổng bằng phản ứng Ninhydrin
Chuẩn bị hóa chất:
27
-Dung dịch Ninhydrin: 500 mg Ninhydrin được hòa tan trong 10 ml cồn tuyệt đối.
-Dung dịch phenol 80%: 80 gam thuốc thử phenol hòa tan trong 20 ml cồn tuyệt đối, lắc nhẹ, để lắng sau 20 phút chiết lớp trên thu dung dịch phenol
-Thuốc thử KCN-pyridin: 2 ml 0,01M KCN được pha loãng đến 100 ml bằng pyridin ammonia
-Ethanol 60%
Phản ứng:
Phản ứng gồm 0,5 ml dung dịch axit amin, 1ml thuốc thử KCN-pyridine và 1ml dung dịch phenol 80% trong bể ổn nhiệt 1000C. Sau khi đạt được nhiệt độ sôi bổ sung tiếpdung dịch Ninhydrin, đậy kín ống. Phản ứng xảy ra trong 5 phút, sau đó làm lạnh nhanh và bổ sung10ml Ethanol 60%. Đo độ hấp phụ mầu với dung dịch Ninhydrin ở bước sóng 570nm.Dựng đường cong chuẩn xác định hàm lượng axit amin tổng.
3.2.10. Phương pháp thu thành tế bào
Phương pháp: cho dịch lên men ly tâm 6000v/phút, trong 20 phút, rửa 2 lần bằng đệm citrat photphat, pH = 5,5. Hoà cặn tế bào trong 1 lít 4% NaOH, đun nóng đến 1000C, khuấy mạnh trong 1 giờ. Để nguội ở nhiệt độ phòng, thêm 1 lít nước lạnh để dừng phản ứng. Ly tâm 4000 v/phút trong 15 phút.Thu cặn (thành tế bào) và bảo quản ở 40C cho đến khi sử dụng.
3.2.11. Tinh sạch axit amin bằng phương pháp trao đổi ion
- Dùng hai loại hạt trao đổi ion là cation và anion. Mỗi loại hạt ion được nhồi vào một cột trao đổi ion là cột inox tự chế có kích thước 10x120cm. Hai cột được nối liên tiếp với nhau bằng ống nhựa. dịch sử lý sẽ qua cột cation trước, sau đó qua cột anion.
- Lượng hạt ion Dowex-50W nhồi vào mỗi cột là 5,6 kg, chiếm 3/4 thể tích của cột.
- Xử lý hạt trao đổi ion trước khi sử dụng
+ Đối với hạt cation: trước khi sử dụng, hạt cation được ngâm trương nở trong dung dịch NaOH 5 % trong thời gian 3- 4 giờ. Gạn dung dịch kiềm ra và rửa lại bằng nước cất đến sạch kiềm rồi dùng dung dịch HCl nồng độ từ 5 đến 15 % rửa
28
tiếp theo thứ tự 5 thể tích HCl 5 %; 5 thể tích 10 % và 5 thể tích 15 %. Sau đó dùng nước cất rửa đến trung hoà.
+ Đối với hạt anion: Anionit sau khi trương nở trong NaCl bão hoà được rửa tiếp bằng dung dịch HCl 2 % rồi rửa với NaOH 4 % và nước cất đến trung hoà.
3.2.12. Phương pháp xác định hàm lượng chất béo theo Lecoq (1965)
2 gam mầu bổ sung 50 ml HCl 4N gia nhiệt hồi lưu ở 1000C trong 1 giờ. Làm lạnh, lọc bỏ dịch, cặn được hòa tan bằng petrolium ether, lọc thu dung môi. Thu dầu sau khi cho bay hơi hết dung môi, cân thu chất béo.
3.2.13. Phương pháp tách chiết -glucan tổng số
Phương pháp 1: -glucan được thu hồi theo phương pháp dùng kiềm của Williams.
Phương pháp 2: -glucan được thu hồi theo phương pháp kiềm-axit của Williams và Hunter.
Phương pháp 3: -glucan được thu hồi theo phương pháp enzyme của Freimund, Porchalearn và Liu.
3.2.14. Phương pháp xác định hàm lượng -glucan (theo phương pháp McCleary
và Glennie-Holmes (1985)
Sử dụng kit phân tích -glucan bằng enzyme của công ty Megazyme International Ireland Ltd, Wicklow, Ireland.
Bộ Kit phân tích bao gồm 5 loại dung dịch, phân tích được khoảng 100 mẫu. - Chai dung dịch 1: Lichenase [specific, endo-(1-3)(1-4)-β-D-glucan 4- glucanohydrolase], dung tích 1 mL. Pha loãng V=20 ml trong buffer sodium phosphat 20mM, pH=6.5, giữ ở -200C.
- Chai dung dịch 2: β-Glucosidase dung tích 1 mL. Pha loãng V=20 ml trong buffer sodium acetate 50mM, pH= 4.0, giữ ở -200C.
- Chai dung dịch 3: GOPOD Buffer cho phản ứng. Buffer (48 mL, pH=7.4),
p-hydroxybenzoic axit và sodium azide (0.4 % w/v). Pha loãng bằng nước cất thành 1lít dung dịch, dung dịch sử dụng ngay.
-Chai4: GOPOD Enzymes. Glucose oxidase plus peroxidase, 4- aminoantipyrine. Dạng bột
- Chai dung dịch 5: Dung dịch D-Glucose chuẩn (5 mL, 1.0 mg/mL) trong 0.2 % benzoic axit (w/v)
29
Mẫu chứa -glucan hòa tan trong HCL đậm đặc, sau đó thủy phân có gia nhiệt hồi lưu mẫu trong dung dịch HCl 1.3 N ở 1000C trong 1 giờ. Sau đó bổ sung 10ml KOH 2N, chuyển toàn bộ mẫu vào bình định mức 100 ml, bổ sung buffer sodium acetate pH=5 chỉnh đến vạch định mức. Dịch đem lọc qua màng lọc Whaterman GF/A trước khi dịch bị chuyển mầu. Thủy phân D-glucose bằng endo- 1,3--glucanase (20 U/ml) và -glucosidase (4 U/ml) ở 400C trong 60 phút. Kết thúc, bổ sung 3ml gluco oxidase/peoxidase vào dịch huyền phù phía trên, giữ 400C trong 20 phút. Dịch đo tại bước sóng 510 nm, trên máy UV-vis. Dung dịch blank 0.2ml buffer sodium acetate pH=5 có bổ sung 3ml gluco oxidase/peoxidase. - glucan tổng được xác định ở cả phẩn cặn và phần dịch thủy phân tế bào.
3.2.15. Phương pháp xác định hàm lượng chất béo
Phân tích theo TCVN4331:2009
Lipid là este phức tạp của rượu bậc 3 glyerin và axit béo caocaps (axit panmitic, stearic, oleic, linoleic…)
Xác định lipid dựa vào tính chất đa số chất lipid đều hoà tan trong các dung môi hữu cơ như ete etylic, cacbon disunfua, ete petrol…Dung môi nào có nhiệt độ sôi thấp và tỷ trọng càng nhỏ thì hoà tan và chiết lipid ra khỏi thực phẩm càng nhanh và càng dễ làm bốc hơi đi. Trong phòng thí nghiệm hay dùng ete petrol. Các ete này hoà tan nhanh các lipid như axit béo, phosphtit, sáp, các rượu béo, andehyt, xeton, các chất màu…
Hỗn hợp các chất béo được chiết bằng ete etylic gọi là béo thô, thành phần béo thô chiết được phụ thuộc vào dung môi dùng vì độ tan của các chất béo khác nhau trong mỗi loại dung môi là không giống nhau.
Chất béo thô được xác định theo phương pháp trực tiếp là chiết bởi dung môi. Một trong những ohương pháp trực tiếp xác định chất béo chính xác nhất là chiết bằng máy Soxhlet.
Nguyên tắc: Dựa vào tính chất các dung môi hữu cơ có khả năng hoà tan và
rút được chất béo ra khỏi mẫu phân tích. Sau khi tách được chất béo, đun đuổi dung môi ra khỏi chất béo và sấy khô chất béo đến trọng lượng không đổi.
Tiến hành: Cân 5 g mẫu cho vào bầu chiết của máy chiết Soxhlet chiết ở 700C, trong 6-8giờ. Chuyển dung môi đã chiết béo sang bình cầu sau đó cất đuổi dung môi, cân cốc, tìm ra lượng chất béo.
30
Cách tính
Chất béo % = × 100 G1: Trọng lượng cốc chứa mẫu, g G2: Trọng lượng cốc chứa chất béo, g G: Trọng lượng mẫu, g
3.2.16. Phương pháp xây dựng công thức và đánh giá lý thuyết năng lượng của sản phẩm sản phẩm
Sử dụng các bảng để tính toán lượng lương thực, thực phẩm có trong công thức; dựa vào bảng để tính ra các chất dinh dưỡng của công thức dự kiến. Tiến hành theo các bước đánh giá khẩu phần như sau:
Bước 1. Tính thành phần các chất dinh dưỡng trong khẩu phần: Dựa vào "Bảng
thành phần dinh dưỡng thực phẩm Việt Nam" để tính: Thành phần các chất dinh dưỡng trong mỗi loại thực phẩm được tính theo công thức:
- Tính toán các loại thực phẩm khác rồi đưa kết quả tính được vào bảng sau
Bảng 3.1. Bảng tính toán các loại thực phẩm khác
TT Tênthực
phẩm
Các chất sinh năng lượng Năng lượng (Kcal)
Protid Lipid Glucid
ĐV TV ĐV TV
* Tính tỉ lệ cân đối giữa các chất dinh dưỡng
- Cân đối giữa các chất sinh năng lượng
+ Tỷ lệ % năng lượng do protid cung cấp =Số gam protid x 4 x 100
Calo chung
31
+ Tỷ lệ % năng lượng do lipid cung cấp = ố
+ Tỷ lệ % năng lượng do glucid cung cấp = ố
- Cân đối trong bản thân các chất sinh năng lượng
+ Tỷ lệ % protid động vật/protid chung = ố độ ậ
+ Tỷ lệ % lipid thực vật/lipid chung = ố ự ậ
Bước 2: Đánh giá lý thuyết khẩu phần
Bảng 3.2. Đánh giá lý thuyết khẩu phần
STT Các chỉ số dinh dưỡng Kết quả Đánh giá
1 Tỷ lệ % năng lượng do Protid Lipid Glucid 2 Tỷ lệ P động vật/ P chung 3 Tỷ lệ L thực vật/ L chung
Bước 3: Đánh giá mức đáp ứng nhu cầu
+ Mức đáp ứng nhu cầu đề nghị (%) = ế ả
ầ đề ị
Bảng 3.3. Đánh giá mức đáp ứng nhu cầu
Chấtdinh dưỡng Năng lượng Protid Vitamin Chất khoáng
Kết quả tính toán Nhu cầu đề nghị Mức đáp ứng nhu cầu
32
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Nghiên cứu xác định các điều kiện thủy phân nấm men bia để sản xuất axit
amin và –glucan
4.1.1. Nghiên cứu lựa chọn điều kiện tự phân nấm men
Các yếu tố ảnh hưởng đến tự phân nấm men bao gồm tỷ lệ nấm men/ dung môi, nhiệt độ, pH và thời gian tự phân do vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố trên tới sự thủy phân nấm men.