PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.8. Tác hại của màng sinh học
Trong đời sống, dễ nhận thấy nhất là các màng sinh học thường gây tắc nghẽn và ăn mòn. Màng sinh học chiếm 20% trong các tác nhân gây ăn mòn đường ống dẫn dầu trên biển. Lớp màng sinh học trên thân tàu khiến các sinh vật biển như hàu dễ bám vào tàu hơn, làm giảm tốc độ con tàu, kéo dài thời gian di chuyển và tiêu tốn thêm nhiên liệu. Màng sinh học bám bên trong động cơ làm giảm hiệu suất vận hành máy móc.
Vốn tập hợp một lượng lớn vi khuẩn, màng sinh học còn là nguồn gốc nhiều căn bệnh viêm nhiễm ở người. Các nhà khoa học cho biết, có thể tìm thấy hơn 400 lồi vi khuẩn khác nhau trong cao răng với mật độ khoảng 10 tỷ con vi khuẩn/ mg. Khoảng 15 - 20% ca nhiễm trùng đường tiết niệu có nguyên nhân bắt nguồn từ màng sinh học trong cơ thể.
Màng sinh học có thể hình thành trên bề mặt lớp tế bào biểu mơ như: lớp xơ hóa gây nhiễm trùng phổi, lớp mủ nhiễm trùng trên một vết thương, biểu mô ống dẫn niệu, xoang mũi, xoang miệng, thậm chí trên bề mặt thiết bị y tế đặt trong cơ thể như van tim nhân tạo, niệu quản nhân tạo…. Đặc biệt, màng sinh học sẽ trở thành nguồn lây nhiễm bệnh cực kỳ nguy hiểm nếu chúng hình thành trên các thiết bị y tế thơng dụng.
Sự hình thành biofilm của vi khuẩn ở vết thương ngồi da có thể làm giảm hiệu quả kháng khuẩn tại chỗ trong chữa bệnh và điều trị vết thương.
Các vi khuẩn nằm trong lớp màng sinh học có thể đề kháng với chất kháng khuẩn cao gấp 1000 lần so với các tế bào vi khuẩn tự do cùng loài. Lý giải về khả năng đề kháng này là do tốc độ phát triển chậm hơn trong biofilm và sự giảm khuếch tán các chất kháng khuẩn qua mạng lưới polysaccharide ngoại bào (Chambless, 2006). Chính đặc điểm này, bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn sản sinh biofilm thường tiến triển mạn tính và khó điều trị hay khơng thể điều trị được.
Ở động vật, gần đây kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học ở Mỹ cho thấy màng sinh học sản sinh bởi nhiều loại vi khuẩn như Actinobacillus pleuropneumoniae, Escherichia coli, Salmonella và Streptococcus suis giúp bảo tồn một số virus như PRRSV và PCV2 ít nhất trong vịng 72 giờ ở ngồi mơi trường (Jacques, 2015).
Một số vi khuẩn gây bệnh thường gặp trong màng sinh học: Staphylococcus aureus gây nhiễm khuẩn, áp xe; Salmonella typhi gây bệnh thương hàn; Enterococcus faecalis gây nhiễm trùng đường ruột; Pseudomonas aeruginosa làm suy giảm miễn dịch, nhiễm trùng hệ thống hô hấp, viêm phổi, nhiễm trùng đường tiểu, nhiễm trùng máu…
2.9. BIỆN PHÁP KIỂM SỐT SỰ HÌNH THÀNH MÀNG SINH HỌC
Trong chăn nuôi, ở một số nước tiên tiến người ta đã sử dụng công nghệ phủ nano (nanocoating) trên bề mặt các thiết bị như sàn nhà, khung chuồng, bồn chứa nước, ống dẫn nước, máy hút bụi, máy thơng gió, v.v... Lớp nano bạc phủ trên bề mặt có tác dụng diệt khuẩn và ngăn cản sự hình thành biofilm.
Đối với nguồn nước, các loại thuốc khử trùng như chlorine, chloramines, ozone, hydrogen peroxide thường được sử dụng để phá vỡ các màng sinh học.
Hiện nay, hướng nghiên cứu tìm các loại hóa chất/ chất chiết từ thực vật làm hạn chế sự hình thành màng sinh học cũng được quan tâm. Một số chất chiết từ cây Dioscorea altissima, và Annona hypoglauca đã được chứng minh có khả năng ngăn cản sự hình thành biofilm của Streptococcus mutans (Barnabe, 2014). Trong một số nghiên cứu khác, sử dụng aspirin ở nồng độ từ 0,43 mM đến 1,73 mM đã làm giảm rõ rệt mức độ sản sinh biofilm của nấm Candida spp. (Stepanovic, 2004). Sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp giữa aspirin và EDTA cũng được chứng minh là có hiệu quả cao trong việc ngăn chặn sự hình thành biofilm của nhiều loại vi khuẩn như Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli và Candida albicans (Al‐Bakri, 2009).
2.10. ỨNG DỤNG CÓ LỢI CỦA MÀNG SINH HỌC 2.10.1. Ứng dụng màng sinh học trong việc xử lý nước thải 2.10.1. Ứng dụng màng sinh học trong việc xử lý nước thải
Trong cấu trúc màng sinh học, các vi sinh vật liên kết với nhau chặt chẽ, tạo ra một cấu trúc bền vững, hoạt động có hiệu quả hơn trong việc xử lý nước thải. Đồng thời, các vi sinh vật trong mạng lưới màng sinh học sẽ cùng hợp tác trao đổi chất giúp cho quá trình loại bỏ các chất gây ơ nhiễm trong nước diễn ra dễ dàng và hiệu quả (Steyn, 2005).
So sánh với việc sử dụng các chủng vi sinh vật trơi nổi để xử lý nước thải thì cơng nghệ xử lý sinh học nước thải bằng màng sinh học mang lại nhiều lợi ích đáng kể. Một là, mật độ các chủng vi sinh vật trong màng sinh học cao hơn nhiều, tạo điều kiện xử lý tối đa nguồn nước thải. Hai là, ngoài việc loại bỏ các chất không mong muốn trong nước thải thì quá trình tiếp theo là loại bỏ các vi sinh vật này khỏi môi trường. Đối với các tế bào trôi nổi, việc khử trùng nguồn nước sẽ tốn một chi phí lớn, do vậy việc áp dụng màng sinh học trên các giá thể cố định thể hiện ưu thế lớn. Với những ưu điểm này, các nhà khoa học đã đề xuất công nghệ xử lý nước thải ứng dụng màng sinh học được xem là giải pháp thân thiện môi trường (Lazarova, 2000).
Ở Việt Nam, đã phân lập được một số vi sinh vật có khả năng sản sinh biofilm như Rhodoccus B2, Rhodoccus B15, Rhodoccus B16, Bacillus, Candida viswanathii TH1, Candida tropicalis TH4 ứng dụng trong xử lý nước bị ô nhiễm dầu; hoặc Bacillus licheniformis ứng dụng trong xử lý nước thải có hợp chất photpho.
Trên thế giới, người ta đã chế tạo được các chất mang như (Kaldnes carrier K1, K3, K5 hoặc BiofilmChip) cho phép vi sinh vật có khả năng hình thành biofilm phát triển, được ứng dụng trong công nghệ xử lý nước thải đô thị, với tên gọi Moving Bed Biofilm Reactor. Trong công nghệ này, hệ vi sinh vật được hình thành và phát triển trên vật mang gồm Gammaproteobacteria, Deltaproteobacteria, Clostridiales, Epsilonproteobacteria, Euryarchaeota và Crenarchaeota.
2.10.2. Ứng dụng màng sinh học trong việc ức chế các vi sinh vật gây hại
Các vi sinh vật có thể tồn tại tự do trong đất hoặc bám dính với bề mặt mơ thực vật thành từng cụm tế bào. Mối quan hệ này phần lớn mang lại lợi ích cho cả hai bên: thực vật là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng và nơi khu trú lâu dài cho các quần thể vi sinh vật. Mặt khác, các vi sinh vật trong mối tương tác này có thể làm thay đổi mơi trường sống xung quanh theo hướng có lợi cho sự phát triển của thực vật (Ramey, 2004).
Một trong những cơ chế giúp các vi sinh vật ức chế mầm bệnh gây hại ở cây trồng đó là thơng qua chất kháng sinh. Ví dụ, chủng Bacillus cereus UW85 có
khả năng tổng hợp cả zwittermycin và kanosamine (Ramey, 2004). Khả năng tổng hợp chất kháng sinh giúp làm tăng tính cạnh tranh giữa các nhóm vi sinh vật; đồng thời cũng là cơ sở để tạo ra các chế phẩm vi sinh vật có khả năng phịng trừ bệnh gây hại ở thực vật chủ yếu dưới dạng phân bón vi sinh bổ sung vào nguồn đất trồng.
(Bais 2004), đã chứng minh rằng nhờ quá trình hình thành màng sinh học trên rễ cây Arabidopsis, chủng vi khuẩn Bacillus subtilis 6051 đã tạo ra surfactin ức chế sự xâm nhiễm của chủng P. syringae gây hại cây trồng.
Khả năng đối kháng của chủng Bacillus thuringiensis chống lại tác nhân gây bệnh cây trồng Erwinia carotovora đã được chứng minh qua nghiên cứu vào năm 2006 của (Morikawa, 2006a) E. carotovora sản xuất các phân tử tín hiệu cảm ứng mật độ tế bào acyl - HSL và biểu hiện gen gây độc, trong khi đó các chủng B. thuringiensis có enzyme acyl - homoserine lactonase, làm giảm mạnh acyl - HSL. Do vậy, B. thuringiensis làm giảm đáng kể khả năng nhiễm và phát triển của E. carotovora - tác nhân gây bệnh thối củ ở khoai tây.
2.10.3. Một số nghiên cứu ứng dụng khác
2.10.3.1. Ứng dụng của màng sinh học làm giảm sự ăn mòn kim loại
Vi khuẩn gây ra sự ăn mòn kim loại được biết đến là các chủng vi khuẩn khử sulfate Desulfosporosinus orientis và vi khuẩn oxy hóa sắt Leptothrix discophora SP-6. D. orientis gây ra sự ăn mòn ở gang, thép cacbon, thép không gỉ và một số hợp kim khác. Hằng năm, thiệt hại do sự ăn mòn kim loại gây ra ở Mỹ là 4 - 6 tỷ USD (Costerton, 1974). Vi khuẩn này có chứa enzyme hydrogenase sử dụng hydrogen như một chất cho điện tử để thu nhận năng lượng gây ra hiện tượng ăn mòn điện hóa ở các bề mặt kim loại. Trong khi đó, vi khuẩn L. discophora SP-6 oxy hóa sắt, tự nó khơng gây ra sự ăn mịn đáng kể thép nhẹ (thép ít cacbon), nhưng khi có sự kết hợp với D. orientis và Paenibacillus polymyxa 10401 thì tốc độ ăn mịn thép nhẹ sẽ tăng lên rất lớn (Emerson, 1992). Nghiên cứu của (Morikawa, 2006a), cho thấy sự hình thành màng sinh học ở chủng Bacillus brevis 18-3 đã tạo ra gramicidin làm giảm đáng kể tốc độ ăn mòn kim loại bằng cách ức chế cả hai chủng vi khuẩn D. orientis và L. discophora SP-6.
2.10.3.2. Trong công nghiệp lên men
Trong các bồn lên men ở quy mơ cơng nghiệp, màng sinh học là hình thức hiệu quả để giữ lại sinh khối vi sinh vật (Kubota, 2008). Khi đã được bám giữ trên bề mặt giá thể bằng mạng lưới màng sinh học, sinh khối vi sinh vật có thể được giữ lại một cách có hiệu quả sau mỗi mẻ xử lý cũng như tái sử dụng được ở những lần xử lý tiếp theo mà không cần phải bổ sung thêm vi sinh vật cũng như đợi thời gian phát triển.
2.10.3.3. Ứng dụng trong cơng nghiệp dầu khí
Nghiên cứu khả năng tổng hợp chất hoạt động bề mặt sinh học (biosurfactant) hoạt tính cao từ chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, được phân lập từ nguồn nước thải nhiễm dầu (Pornsunthorntawee, 2009), mở ra triển vọng ứng dụng trong cơng nghiệp dầu khí với các mục đích như nâng cao hệ số thu hồi dầu, xử lý môi trường, làm chất phân tán và nhũ hóa cặn dầu.
Tiểm ẩn rất nhiều hiểm nguy, nhưng màng sinh học cũng là lĩnh vực nghiên cứu thú vị và đầy thử thách, mang lại kho kiến thức hữu ích về tác động của vi khuẩn đối với vạn vật xung quanh. Những nghiên cứu về màng sinh học không chỉ ngăn ngừa tác hại của vi khuẩn mà còn ứng dụng chúng trong nhiều lĩnh vực, từ công nghiệp cho đến y tế. Bằng cách chọn lựa loại vi khuẩn đặc trưng, thay đổi tỷ lệ vi khuẩn, dung môi… các nhà khoa học có thể tạo ra màng sinh học với tính năng đa dạng.
PHẦN 3. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Tụ cầu khuẩn Staphylococcus spp phân lập được ở đường hô hấp của gà nuôi tại huyện Gia Lâm – Hà Nội và một số tỉnh lân cận như Bắc Giang, Vĩnh Phúc và Hải Dương.
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Để đạt được những mục tiêu nghiên cứu đã đề ra, chúng tôi đã thực hiện một số nội dung sau:
Phân lập và thuần khiết vi khuẩn;
Nghiên cứu khả năng sinh trưởng của vi khuẩn;
Định lượng khả năng sản sinh màng sinh học của vi khuẩn;
Nghiên cứu biến động của quá trình sản sinh màng sinh học theo thời gian; Nghiên cứu khả năng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn hình thành màng
sinh học.
3.3. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu được thực hiện tại phịng thí nghiệm của bộ mơn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.4. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Đề tài được thực hiện trong thời gian từ tháng 4/2015 đến tháng 3/2016.
3.5. NGUYÊN LIỆU
- Tăm bông vô trùng.
- Thạch thường của hãng Merck.
- Môi trường lỏng: tryptone water, tryptic soy broth, peptone water của hãng Merck.
- Giấy tẩm kháng sinh, kháng sinh bột.
- Đĩa nhựa 96 giếng vô trùng (SPL Life Sciences).
- Hóa chất dùng trong định lượng màng sinh học: methanol, đệm PBS 1x, dung dịch 1% tím kết tinh (crystal violet), dung dịch cồn 80% có bổ sung 5% sodium dodecyl sulfate.
- Máy đọc ELISA (Biotek, ELx808).
3.6. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.6.1. Phương pháp lấy mẫu 3.6.1. Phương pháp lấy mẫu
Dịch hầu họng được lấy ngẫu nhiên từ một số đàn gà nuôi tại huyện Gia Lâm, Hà Nội và một số tỉnh lân cận như Bắc Giang, Vĩnh Phúc và Hải Dương. Dùng tăm bông vô trùng lấy dịch hầu họng, xoang mũi của gà. Các mẫu tăm bông được bảo quản trong đệm trypton và bảo quản ở 4oC trong suốt quá trình vận chuyển mẫu.
3.6.2. Phương pháp phân lập, thuần khiết vi khuẩn hiếu khí
Vi khuẩn hiếu khí được phân lập và thuần khiết theo quy trình thường quy của bộ mơn Vi sinh vật- Truyền nhiễm, Khoa Thú y. Các bước được tóm tắt như sau: (i) ria cấy tăm bông thấm dịch swab trên đĩa thạch thường và nuôi cấy trong tủ ấm 37oC/24h. (ii) Lựa chọn những khuẩn lạc màu trắng hoặc vàng, dạng S, có kích thước to hoặc nhỏ để thuần khiết. (iii) Nhuộm Gram, chọn mẫu có tụ cầu
khuẩn cho các nội dung nghiên cứu tiếp theo.
3.6.3. Phương pháp xác định khả năng sản sinh màng biofilm
Định lượng khả năng sản sinh màng sinh học được thực hiện trên đĩa 96 giếng (Stepanovic, 2007). Các bước được tóm tắt như sau:
Bước 1: Nuôi cấy vi khuẩn bằng môi trường lỏng
- Chuyển 1 ml huyễn dịch vi khuẩn (pha trong TSB+Y) vào 9 ml dung dịch TSB+Y vô trùng. Nuôi tĩnh ở 37oC trong vòng 12 giờ. Huyễn dịch vi khuẩn là nước rửa mặt thạch chủng tụ cầu khuẩn thuần khiết.
- Chuyển 1 ml vi khuẩn sau nuôi cấy 12 giờ trong môi trường TSB+Y vào ống nghiệm chứa 9 ml môi trường TSB+Y mới, vô trùng. Trộn đều.
Bước 3: Nuôi cấy tĩnh
- Chuyển 100 µl huyễn dịch vi khuẩn (1/10) vào mỗi giếng của đĩa nhựa vơ trùng 96 giếng (đã có sẵn 100 µl môi trường TSB+Y). Nuôi tĩnh ở 37oC/24 giờ.
Bước 4: Rửa trôi vi khuẩn không bám vào thành/ đáy đĩa
- Loại bỏ hồn tồn vi khuẩn khơng nằm trong màng sinh học bằng cách rửa mỗi giếng bằng 200 µl PBS 1x; lặp lại 3 lần. Thấm khô giếng.
Bước 5: Cố định màng sinh học
- Cố định vi khuẩn bám vào thành/ đáy đĩa bằng 200 µl methanol; - Giữ đĩa ở nhiệt độ phịng trong 20 phút;
- Loại bỏ hồn tồn methanol trong giếng bằng cách thấm khô.
Bước 6: Nhuộm màng sinh học
- Bổ sung vào mỗi giếng 200 µl dung dịch tím kết tinh 1%; - Giữ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 15 phút;
- Loại bỏ hồn tồn dung dịch tím kết tinh;
- Loại bỏ hồn tồn thuốc nhuộm thừa (khơng thấm vào lớp màng sinh học) bằng cách rửa mỗi giếng bằng 200 µl PBS 1x; lặp lại ít nhất 3 lần cho đến khi khơng cịn màu của thuốc nhuộm sau khi thấm khơ giếng.
Bước 7: Đo mật độ quang
- Hịa tan thuốc nhuộm tím kết tinh thấm vào màng sinh học bằng cách bổ sung vào mỗi giếng 200 µl dung dịch ethanol 95%;
- Giữ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút; - Đo giá trị OD ở bước sóng 595 nm.
Bước 8: Phân tích kết quả
Đánh giá mức sản sinh màng sinh học được thực hiện theo tác giả Stepanovic (2000). Tính tốn kết quả theo cơng thức sau: ODc = ODđc +3SD. Trong đó: (ODđc là giá trị OD trung bình của các mẫu đối chứng âm, SD là độ lệch chuẩn của giá trị OD của các mẫu đối chứng âm). Mẫu dương tính (sản sinh màng sinh học) là mẫu có giá trị ODmẫu > ODc. Mức tạo màng sinh học được đánh giá như sau:
ODmẫu ≤ ODc : Không tạo màng sinh học
ODc < ODmẫu ≤ 2ODc : Tạo màng sinh học yếu 2ODc < ODmẫu ≤ 4ODc : Tạo màng sinh học trung bình
4ODc < ODmẫu : Tạo màng sinh học mạnh
3.6.4. Phương pháp nghiên cứu biến động biofilm theo thời gian
Để nghiên cứu biến động của sự sản sinh màng sinh học theo thời gian,