2.1. Vật liệu
2.1.1. Mẫu vật: Các lá cây đước (Rhizophora apiculata Blume, thuộc họ đước –
Rhizophoraceae) đang trong giai đoạn phân huỷ (có màu vàng hoặc nâu), rơi rụng trên
mặt nước hoặc trên lớp bùn của vùng rừng ngập mặn của một số tỉnh phía Bắc và Nam (bảng 2.1). Lá được rửa qua bằng nước biển, cho vào túi nilon, ghi địa điểm thu mẫu, bảo quản ở nhiệt độ mát. Các mẫu lá này là nguyên liệu để phân lập Schizochytrium.
Bảng 2.1. Thời gian và địa điểm thu mẫu
Địa điểm Thời gian
Phú Quốc- Kiên Giang 3/2008
Diêm Điền- Thái Bình 4/2008
Tĩnh Gia- Thanh Hoá 5/2008
Thị Nại- Bình Định 2/2010
Tiên Yên- Quảng Ninh 5/2010
2.1.2. Vi sinh vật
- Tế bào vi khuẩn E. coli chủng DH5α [F– Φ80lacZΔM15 Δ (lacZYA-argF) U169 recA1
endA1 hsdR17 (rK–, mK+) phoA supE44 λ– thi-1 gyrA96 relA1 được sử dụng làm vật chủ tách dòng.
- Các loài vi tảo quang tự dưỡng bao gồm Chaetoceros gracilis, Chlorella sp.,
Isochrysis galbana, Nannochloropsis occulata thuộc tập đoàn giống của Phòng Công
nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.1.3. Các bộ sinh phẩm: Kit tách dòng TOPO TA Cloning® kit (InvitrogenTM), kit làm phản ứng xác định trình tự ABI Prism® Big Dye® Terminator v3.1 cycle làm phản ứng xác định trình tự ABI Prism® Big Dye® Terminator v3.1 cycle sequencing (Applied Biosystem), kit Wizard SV clean-up (Promega) để tinh sạch DNA.
2.1.4. Động vật thí nghiệm
Chuột cống trắng, chuột nhắt trắng, thỏ nhà khỏe mạnh có trọng lượng trung bình 120-150 g/ con; 20,0 ± 2,0 g và 2,0-2,5 kg, tương ứng, do Trung tâm chăn nuôi
Học Viện Quân Y cung cấp. Các động vật này được nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm chuyên dùng, ăn thức ăn tổng hợp tại khoa Dược lý học lâm sàng – Học Viện Quân Y 103.
Luân trùng (Brachionus plicatilis) do Trung tâm giống thuỷ sản miền Bắc, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thuỷ sản I cung cấp. Bào xác Atermia do hãng INVE Aquaculture Inc., USA sản xuất.
Cua xanh giống (Scylla serrata Forskal, 1775) và cá Chẽm (Lates calcarifer
Bloch, 1790) được nuôi tại trại thực nghiệm của Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 3 (Nha Trang – Khánh Hòa).
2.2. Hoá chất
- Các hóa chất dùng để phân lập, giữ giống và nuôi trồng vi tảo biển dị dưỡng gồm: glucose (Việt Nam), cao nấm men (Merk, Đức), muối biển nhân tạo (Tropic Marine, Aquarientechk, Wartenberg, Đức), polypepton (Merck, Đức), chloramphenicol (Việt Nam), agar (Việt Nam)...
- Các hoá chất tinh khiết dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử và mô bệnh học của các hãng Invitrogen, Bio-rad, Merk, Promega, Sigma, Takara...bao gồm Xgal, IPTG, ethanol, trypton, cloroform, EDTA, agarose, Hematocylin-Eosin, Nile Red.
- Các hoá chất thông dụng khác dùng trong phòng thí nghiệm do Việt Nam và Trung Quốc sản xuất như saccharose, maltose, glycerol, fructose, (NH4)2SO4, CH3COONH4, NH4NO3, NaNO3, phân N-P-K, Na2SO4, NaCl, methanol, n-hexan…
- Vitamin B1, B6, lactose, talc, và magnesi stearat (Việt Nam) tạo viên Algal Omega-3. - Các chất để làm giàu luân trùng và Artemia: A1 DHA Selco (Artemia International LLC, Mỹ), Golden Power (Tesgofanm Aqva BV, Hà Lan); men bánh mỳ (Saf instant, Pháp).
2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
- Kính hiển vi quang học Olympus CX21 (Nhật Bản); kính hiển vi huỳnh quang NIKON eclipse 80i-Nhật Bản; kính hiển vi điệu tử quét (SEM) JEOL JSM – 6400 (Nhật Bản), buồng đếm số lượng tế bào Burker - Turk (Đức); tủ nuôi cấy vi sinh (Binder, Đức), máy lắc IKA KS 260 basic (Đức); Máy sắc kí khí HP-6890, cân phân
tích (Precisa XT2200A, Thuỵ Điển); máy ly tâm lạnh cỡ lớn (Sorvall, Đức); Máy khử trùng ALP (Nhật Bản); pH kế Melter Toledo (Đức); Máy cô quay chân không IKA (Đức).
- Hệ thống lên men 5, 10 lít (BioFlo-110 ferementor/ Bioreactor, New Brunswick Scientific, USA) có hệ thống tự động điều chỉnh nhiệt độ, khuấy đảo môi trường, pH, lượng oxy hòa tan và đầu dò đo mức độ tạo bọt của môi trường lên men; hệ thống làm mát để hạ nhiệt bằng nước lạnh hoặc kết hợp với lớp áo gia nhiệt để nâng nhiệt độ môi trường lên men. Khí được nén bởi máy nén khí không dầu, sau đó được làm mát, tách ẩm và bụi rồi qua phin lọc khí vô trùng trước khi cấp vào bình lên men. Toàn bộ quá trình lên men có thể được điều khiển bằng phần mềm của hệ thống máy tính.
- Bình lên men 30 lít tự tạo: không có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ, pH cũng như đo lượng oxy hòa tan …Quá trình lên men được tiến hành ở nhiệt độ phòng. Không khí được cấp từ máy nén khí qua cột lọc thô và phin lọc khí vô trùng trước khi được sục vào bình lên men. Tốc độ cánh khuấy được cố định vào khoảng 300-400 vòng/phút. - Máy chạy PCR GeneAmp® PCR System 9700 (ABI, Mỹ); bộ điện di DNA (Advance Tech, Nhật Bản), máy soi DNA (Bio-Rad, Mỹ); máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100- Avant Genetic Analyzer (Mỹ); máy li tâm Eppendorf 5415 (Eppedorf, Đức); bể ổn nhiệt Memmerl (Đức); máy quang phổ UV-1650PC (Nhật Bản).