2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Các cơ sở giết mổ đang hoạt động trên địa bàn huyện Quảng Trạch và thị xã Ba Đồn, tỉnh Quảng Bình.
- Thịt lợn được lấy từ một số cơ sở giết mổ và cơ sở kinh doanh trên địa bàn huyện Quảng Quảng Trạch và thị xã Ba Đồn, tỉnh Quảng Bình.
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu
- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 8/2017 đến tháng 02/2018
- Đề tài được thực hiện tại: huyện Quảng Trạch và thị xã Ba Đồn, tỉnh Quảng Bình. - Địa điểm lấy mẫu: các cơ sở giết mổ và kinh doanh tại xã Quảng Phú, huyện Quảng Trạch và phường Quảng Long, thị xã Ba Đồn.
2.1.3. Địa điểmxét nghiệm mẫu
- Tại Phòng thí nghiệm Vi trùng - Truyền nhiễm, Khoa Chăn nuôi - Thú y, Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Đánh giá các chỉ tiêu tại cơ sở giết mổ nhỏ lẻ
Được thực hiện theoPhụ lục VII, tại Thông tư 09/2016/TT-BNNPTNT, bao gồm: - Địa điểm sản xuất
- Kết cấu nhà xưởng, bố trí sản xuất - Trang thiết bị sản xuất
- Vệ sinh nhà xưởng, trang thiết bị
- Người trực tiếp sản xuất, vệ sinh công nhân - Nguyên liệu và các yếu tố đầu vào sản xuất thực
- Phòng, chống động vật gây hại và xử lý chất thải, nước thải - Điều kiện bảo đảm vệ sinh thú y, ATTP
- Ghi chép và truy xuất nguồn gốc
2.2.2. Xác định mức độ ô nhiễm vi khuẩn trong thịt lợn tại cơ sở giết mổ và cơ sở kinh doanh kinh doanh
2.2.2.1. Tổng số vi khuẩn hiếu khí (TSVKHK) 2.2.2.2. Tổng số Enterobacteriaceae
2.2.3. Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trong không khí tại cơ sở giết mổ và cơ sở kinh doanh sở kinh doanh
2.2.4. Xác định vi khuẩn trong nước tại cơ sở giết mổ
2.2.4.1. Tổng số vi khuẩn hiếu khí (TSVKHK) 2.2.4.2. Tổng số coliform
2.2.4.3. Tổng số coliform từ phân hoặc E.Coli chịu nhiệt
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp điều tra thu thập thông tin
2.3.1.1. Điều tra thực trạng KSGM
Đối với các CSGM nhỏ lẻ: Theo Phụ lục VII tại Thông tư số 09/2016/TT- BNNPTNT lập thành phiếu điều tra để thu thập số liệu hiện trạng hoạt động CSGM.
2.3.1.2. Đánh giá xếp loại cơ sở
Lỗi nhẹ (Mi): là sai lệch so với quy chuẩn kỹ thuật, có thể ảnh hưởng đến an toàn thực phẩm hoặc gây trở ngại cho việc kiểm soát ATTP nhưng chưa đến mức nặng.
Lỗi nặng (Ma): là sai lệch so với tiêu chuẩn, có thể ảnh hưởng đến ATTP, nếu kéo dài sẽ gây mất ATTP, tác động xấu đến môi trường.
Lỗi nghiêm trọng (Se): là sai lệch so với tiêu chuẩn, gây mất ATTP, tác động xấu đến môi trường, ảnh hưởng tới sức khỏe người tiêu dùng.
2.3.1.3. Xếp loại cơ sở
- Đối với CSGM nhỏ lẻ:
Xếp loại
Mức lỗi
Nhẹ (Mi) Nặng (Ma) Nghiêm trọng (Se)
Loại A ≤ 5 0 0 Loại B > 5 đến 9 0 0 Ma ≤ 3 và tổng Mi + Ma ≤ 8 0 Loại C Ma > 3 và tổng Mi + Ma > 8 0 - ≥ 4 0 - - ≥ 1
2.3.1.4. Diễn giải xếp loại
Cơ sở được xếp loại A khi đạt các điều kiện: Không có lỗi nặng và lỗi nghiêm trọng và tổng số sai lỗi nhẹ (Mi) không quá 05 chỉ tiêu.
Cơ sở xếp loại B khi thỏa mãn các điều kiện: Không có lỗi nghiêm trọng và một trong hai trường hợp sau: (1) không có lỗi nặng, số lỗi nhẹ lớn hơn 05 chỉ tiêu; (2) hoặc số lỗi nặng không quá 03 chỉ tiêu và tổng số lỗi nhẹ + nặng không quá 08 chỉ tiêu.
Cơ sở xếp loại C khi vướng vào một trong các điều kiện sau: Có lỗi nghiêm trọng hoặc một trong các trường hợp sau: (1) có số lỗi nặng ≥ 04 chỉ tiêu; (2) hoặc có dưới hoặc bằng 03 lỗi nặng và tổng số lỗi nhẹ + nặng lớn hơn 08 chỉ tiêu.
2.3.2. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu
2.3.2.1. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu thịt
Mẫu được lấy ngẫu nhiên tại một số cơ sở giết mổ và cơ sở kinh doanh thịt tại địa điểm nghiên cứu. Chúng tôi tiến hành lấy 10 mẫu thịt lợn tại 10 CSGM và 10 mẫu thịt tai 10 CSKD. Lấy mẫu và bảo quản mẫu theo QCVN 01 – 04: 2009.
Thời gian lấy mẫu: tại CSGM vào lúc 5 giờ sáng, tại CSKD lúc 8 - 9 giờ sáng. Mẫu đựng trong các hộp vô trùng, bảo quản lạnh và được vận chuyển về phòng kiểm nghiệm, phân tích ngay trong 1 – 2 giờ đầu.
2.3.2.2. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu nước và không khí
a/ Lấy mẫu nước theo TCVN 6187-1,2: 1996, tiến hành lấy 5 mẫu nước tại 5 cơ sở giết mổ.
b/ Lấy mẫu không khí theo phương pháp Koch: Chúng tôi tiến hành lấy 5 mẫu ở CSGM và 5 mẫu ở CSKD.
*/ Tiến hành lấy mẫu:
Tại mỗi điểm lấy mẫu, thông thường nên để 5 đĩa thạch thường. Thời gian mở nắp 15 phút;
- Sau thời gian mở nắp hộp lồng, ghi nhãn và xếp vào hộp chứa mẫu chuyển về phòng thí nghiệm;
- Không làm bật nắp hộp petri khi vận chuyển mẫu và tránh ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp vào mẫu .
*/ Nuôi cấy
- Sau thời gian nuôi cấy, đếm số khuẩn lạc điển hình mọc trong hộp lồng chứa từng loại môi trường để xác định số lượng từng loại vi khuẩn tương ứng để tính kết quả.
*/ Kết quả:
X = Trong đó:
X: Tổng vi sinh vật trong 1 m3 không khí; A : Tổng số vi sinh vật trong một đĩa thạch; S : Diện tích đĩa thạch, cm2;
K : Hệ số thời gian, với K =1 (5 phút), K = 2(10 phút), K =3 (15 phút).
2.3.3. Phương pháp phân tích một số chỉ tiêu vi sinh vật
2.3.3.1. Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trên thịt: TCVN 7136: 2002
* Nguyên tắc
Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn sinh trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử. Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm. Chỉ số này được xác định bằng cách sử dụng kỹ thuật đổ đĩa trên cơ sở số lượng mẫu đã xác định và xem một khuẩn lạc là sinh khối phát triển từ một tế bào hiện diện trong mẫu.
Đếm số khuẩn lạc đã mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ các nồng độ pha loãng khác nhau, sau khi nuôi cấy ở 370C trong 24 - 48 giờ.
Số khuẩn lạc được tính trong 1g hay 1ml mẫu. * Cách tiến hành
Bước 1: lấy mẫu theo QCVN 01 – 04: 2009 Bước 2: đồng nhất mẫu và pha loãng
Đồng nhất mẫu:
Cân 1g thịt cho vào cối đã được tiệt trùng. Sau đó cho thêm vào 9ml dung dịch đệm pepton, tiến hành nghiền nhỏ thịt, ta thu được độ pha loãng 10-1.
Pha loãng mẫu:
Chuẩn bị các ống eppendorf và các micropipette vô trùng. Dịch mẫu đồng nhất được tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng micropipette với đầu tuýp vô trùng hút 0,1ml dịch mẫu 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 0,9ml dung dịch đệm
pepton, trộn đều mẫu trong ống nghiệm cho đồng nhất bằng máy rung (vortex) ta có được độ pha loãng 10-2, tương tự ta lấy 0,1ml dịch mẫu 10-2 cho vào ống nghiệm chứa 0,9ml dung dịch đệm pepton đã chuẩn bị sẵn ta có độ pha loãng 10-3. Cứ tiếp tục như vậy ta sẽ có các nồng độ 10-4, 10-5.
Lưu ý khi pha loãng mẫu:
Nồng độ pha loãng phụ thuộc vào tình trạng vệ sinh của bệnh phẩm, thời gian bảo quản, điều kiện bảo quản, kinh nghiệm người tiến hành thí nghiệm.
Tiến hành thao tác bên ngọn lửa đèn cồn. Các ống nghiệm phải tuyệt đối vô trùng. Sử dụng 1 micropipet 1ml cho 1 nồng độ pha loãng mẫu tránh hiện tượng sai số.
Mỗi lần lấy mẫu phải lắc đều.
Tất cả thao tác phải tiến hành trong điều kiện vô trùng. Bước 3: Cấy mẫu
Đổ môi trường thạch dinh dưỡng PCA đã hấp vô trùng, để nguội 410C, trộn đều bằng cách xoay ngược chiều nhiều lần nhẹ nhàng rồi để các đĩa đông tự nhiên. Dùng micropipet với đầu típ vô trùng hút 0,1ml mẫu ở các nồng độ pha loãng cho vào đĩa petri dàn đều bằng que cấy pasteur. Úp ngược đĩa và ủ ở 36 - 380C trong 24 - 48 giờ. Mỗi nồng độ cấy vào 2 đĩa peptri.
Bước 4: Đọc kết quả
Sau 24 giờ nuôi cấy thì ta tính kết quả sơ bộ bằng cách đếm khuẩn lạc trên đĩa nuôi cấy. Chỉ tính kết quả khi sự phân bố khuẩn lạc trên các đĩa là hợp lý với mối tương quan giữa độ pha loãng và số khuẩn lạc mọc trên đó (Francis and O’Beirne, 2002).
Chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 30 – 300 để tính kết quả.
Tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1g thịt được tính theo công thức sau:
X= C
(n1 + 0,1n2) dV Trong đó:
C - tổng số khuẩn lạc của các đĩa ở hai độ pha loãng được đếm n1 - số đĩa được đếm ở độ pha loãng thứ nhất
n2 - số đĩa được đếm ở độ pha loãng thứ hai d - hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất
2.3.3.2. Phương pháp xác định và tính số lượng Enterobacteriaceae: TCVN 5518- 2:2007
* Nguyên tắc
Mẫu đã được đồng nhất hóa được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose, ủ ở 370C trong 24 giờ, đếm các khuẩn lạc có hình dạng đặc trưng.
* Các bước tiến hành
Bước 1: Lấy mẫu theo QCVN 01 – 04: 2009 Bước 2: Đồng nhất mẫu và pha loãng
Đồng nhất mẫu:
Cân 1g thịt cho vào cối đã được tiệt trùng. Sau đó cho thêm vào dung dịch đệm pepton, tiến hành giã nhỏ thịt, ta thu được độ pha loãng 10-1.
Pha loãng mẫu:
Chuẩn bị các ống eppendorf và các micropipette vô trùng. Dịch mẫu đồng nhất được tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng micropipette với đầu tuýp vô trùng hút 0,1ml dịch mẫu 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 0,9ml dung dịch đệm pepton, trộn đều mẫu trong ống nghiệm cho đồng nhất bằng máy rung (vortex) ta có được độ pha loãng 10-2, tương tự ta lấy 0,1ml dịch mẫu 10-2 cho vào ống nghiệm chứa 0,9ml dung dịch đệm pepton đã chuẩn bị sẵn ta có độ pha loãng 10-3. Cứ tiếp tục như vậy ta sẽ có các nồng độ 10-4, 10-5, 10-6...
Bước 3: Nuôi cấy dịch mẫu
Đổ môi trường thạch dinh dưỡng Eosin Methylene Blue (EMB) đã hấp vô trùng, để nguội 450C, trộn đều bằng cách xoay ngược chiều nhiều lần nhẹ nhàng rồi đổ ra đĩa petri, mỗi đĩa từ 12 -15ml, sau đó để các đĩa đông tự nhiên.
Chọn 2 độ pha loãng liên tiếp, dùng micropipet với đầu típ vô trùng hút 0,1ml dịch mẫu ở các nồng độ pha loãng cho vào đĩa petri. Tương ứng với mỗi độ pha loãng cấy lên 2 đĩa petri. Sau khi hút dịch mẫu ra môi trường thì dùng que dàn, dàn mẫu để mẫu phân tán đều vào môi trường, lật ngược đĩa và để vào tủ ấm ở 36 – 380C trong 24 - 48 giờ.
Quá trình phân tích chỉ tiêu Enterobacteriaceae theo TCVN 5518-2:2007 Bước 4: Đọc kết quả
Sau 24 giờ nuôi cấy mang ra đọc kết quả. Khuẩn lạc của vi khuẩn
Enterobacteriaceae trên môi trường EMB có màu tím ánh kim. Chỉ tính kết quả khi sự phân bố khuẩn lạc trên các đĩa là hợp lý với mối tương quan giữa độ pha loãng và số khuẩn lạc mọc trên đó.
Trên môi trường EMB khuẩn lạc có dạng sau:
Escherichia coli: Khuẩn lạc màu tím đen, lồi, hơi dày, đường kính 2-3 mm với tâm đen chiếm hơn 3/4 đường kính và có ánh kim hơi lục trong ánh sáng phản chiếu.
Enterobacter aerogenes: Khuẩn lạc màu xanh, tương đối dày, đường kính 4 – 6 mm với tâm màu nâu đen, đôi khi có ánh kim.
Citrobacter: Khuẩn lạc màu tím với chút ánh kim.
Klebsiella: Khuẩn lạc màu nâu nhầy.
Salmonella và Shigella: Khuẩn lạc màu hổ phách trong suốt. Chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 30 – 300 để tính kết quả.
Số vi khuẩn Enterobacteriaceae trong 1g thịt được tính theo công thức sau: X = (n C
1 + 0,1n2) dV Trong đó:
C - tổng số khuẩn lạc của các đĩa ở hai độ pha loãng được đếm n1 - số đĩa được đếm ở độ pha loãng thứ nhất
n2 - số đĩa được đếm ở độ pha loãng thứ hai d - hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất.
V- thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa (trong thí nghiệm, V = 1)
2.3.3.3. Phương pháp phát hiện Salmonella
* Nguyên tắc
Salmonella có thể được phát hiện (phân tích định tính) bằng một quy trình gồm 4 bước là tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định Salmonella thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ, và cùng hiện diện chung với một số lượng lớn các vi khuẩn khác thuộc họ Enterobateriaceae có tính cạnh tranh mạnh và ức chế sự tăng trưởng của Salmonella.
Đếm số khuẩn lạc đã mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ các nồng độ pha loãng khác nhau, sau khi nuôi cấy ở 37oC trong 24 giờ.
* Các bước tiến hành
Bước 1: Lấy mẫu theo QCVN 01 – 04: 2009 Bước 2: Đồng nhất mẫu và pha loãng
Cân 25g thực phẩm (thịt tươi) cho vào cối đã được tiệt trùng. Sau đó cho thêm vào 225ml dung dịch đệm Peptone, tiến hành giã nhỏ thịt, ta thu được độ pha loãng 10-1.
Chuẩn bị các ống eppendorf và các micropipette vô trùng. Dịch mẫu pha loãng được tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng micropipet với đầu vô trùng chuyển 0,1ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 0,9ml dung dịch đệm, trộn đều mẫu trong ống nghiệm cho đồng nhất bằng máy trộn (vortex) ta có được độ pha loãng 10-2.
Tiếp tục thực hiện tương tự để có độ pha loãng cần thiết. Bước 3: Nuôi cấy mẫu
Dùng micropipet với đầu vô trùng hút 1ml mẫu ở nồng độ pha loãng 10-1 cho vào môi trường canh thang. Lắc nhẹ nhiều lần để mẫu phân tán đều vào môi trường, bỏ vào tủ ấm ở 37oC trong 24 giờ.
Đổ môi trường thạch dinh dưỡng Salmonella- Shigella Agar (SS agar) đã hấp vô trùng, để nguội 450C, trộn đều bằng cách xoay ngược chiều nhiều lần nhẹ nhàng rồi để các đĩa đông tự nhiên.
Dùng micropipet với đầu típ vô trùng hút 0,1ml mẫu ở các nồng độ pha loãng cho vào đĩa petri. Dùng que dàn, dàn mẫu để mẫu phân tán đều vào môi trường, lật ngược đĩa và ủ ở 370C trong 24 – 48 giờ.
Sau 24 giờ đọc kết quả, dùng que cấy bắt những khuẩn lạc nghi ngờ để thực hiện kỹ thuật cấy thuần.
Bước 4: Đọc kết quả
Sau 24 - 48 giờ mang các đĩa petri đã cấy vi khuẩn ra đọc kết quả. Khuẩn lạc của vi khuẩn Salmonella trên môi trường thạch SS agar có tâm màu đen, viền màu hồng Quy trình kiểm nghiệm này chỉ cho phép phân tích định tính Salmonella, giúp kết luận có hay không có Salmonella hiện diện trong 25g mẫu, không cho phép phân biệt được các dòng Salmonella hiện diện trong mẫu.
2.3.3.4. Phương pháp MPN (Most Probable Number)
* Nguyên tắc:
Phương pháp MPN (phương pháp có số xác suất cao nhất, số tối khả) còn được gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ.
Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loại thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông thường, việc định lượng này được thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm.
Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm định trong từng ống nghiệm (hiện tượng sinh hơi, đổi màu, đục…), ghi nhận số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng.
Sử dụng số liệu này và dựa vào bảng Mac Crady suy ra mật độ vi sinh vật được trình bày dưới dạng số MPN/100 ml hay MPN/1 g mẫu.
* Cách tiến hành:
Bước 1: Lấy mẫu và pha loãng mẫu đến 3 nồng độ liên tiếp thích hợp.
Bước 2: Mỗi độ pha loãng hút 3 lần, mỗi lần 1 ml cấy vào 3 ống nghiệm môi