3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
1.3.4. Nghiên cứu ứng dụng nano trong bảo vệ thực vật
Công nghệ Nano được xem là một trong những biện pháp mới được ứng dụng để kiểm soát các vi sinh vật gây bệnh ở thực vật. Nano bạc được biết đến với một khả năng tiêu diệt nấm và vi khuẩn hại cây trồng rất hiệu quả, nó có thể phòng trừ được bệnh thối hạt và đạo ôn trên cây lúa do nấm Bipolaris sokoriniana và
Magnapothe oryzae gây ra. Nano kẽm có khả năng ức chế sự sinh trưởng và gây hại của nấm Penicilium expansum gây bệnh mốc xanh trên các nông sản phẩm sau thu hoạch (Mujeebur Rahman Khan và Tanveer Fatima Rizvi, 2014).
Nano đồng đã được sử dụng để phòng trừ nấm Phytophthora infestans gây bệnh mốc sương trên cây cà chua (S. Chadchawan, 2015).
Một nghiên cứu của Elamwi và El-shafey, 2013 về sử dụng nano bạc để trừ bệnh đạo ôn hại lúa đã cho kết quả hết sức khả quan. Với các hạt nano bạc khoảng 20- 30 nm đã cho hiệu quả phòng trừ bệnh đạo ôn cao trong cả hai điều kiện thí nghiệm invitro và invivo. Trong điều kiện phòng thí nghiệm, bốn nồng độ 25, 50, 100 và 200 ppm cho thấy sự ức chế đáng kể sự tăng trưởng của sợi nấm và số lượng bào tử/ml. Trong điều kiện nhà kính, phun nồng độ 0, 25, 50, 100 và 200 ppm trên lá cây lúa tại ba thời điểm (3 giờ trước khi lây nhiễm, 1 và 5 ngày sau lây nhiễm nhân tạo với dung dịch bào tử). Kết quả cho thấy, tỷ lệ bệnh ở công thức sử dụng 100 ppm nano bạc ở ở 1 ngày sau lây nhiễm là 15,3% so với tỷ lệ bệnh của các công thức sử dụng thuốc hóa học trừ nấm đạo ôn isoprothiolane (Fuji one) và azoxystrobin (Amistar) ở nồng độ 100 ppm là 19,6% và 14,7%.
Colletotrichum gloeosporioides, gây bệnh thán thư trên cây ăn trái. Một thử nghiệm các nồng độ khác nhau của nano bạc ức chế các tác nhân gây bệnh: Alternaria, Sclerotinia sclerotiorum, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, B. cinereavà
Curvularia lunata, cho thấy sử dụng 5 mg nano bạc cho hiệu quả hạn chế sự phát triển của các loại nấm này (Sondi I và cs, 2004).
Một nghiên cứu khác cho thấy nano lưu huỳnh đã hiệu quả trong hạn chế nấm
A. niger gây bệnh trên các nông sản phẩm (Aguilar và cs, 2010) (Aguilar-Méndez MA và cs, 2010).
Chitosan kết hợp với nano đồng cho khả năng kháng cao các loại nấm A. alternata, M. phaseolina và R. solani trong nghiên cứu in vitro (Krishnaraj và cs, 2012). Nano bạc kết hợp silic có tác dụng kháng nấm Botrytis cinerea mạnh mẽ.
Mousa và cs, 2015 nghiên cứu các hiệu ứng kết hợp của fluconazole và nano bạc cho hoạt tính kháng nấm Phoma glomerata, Phoma herbarum, F. semitectum, Trichoderma sp. và C. albicans bằng kỹ thuật đĩa khuếch tán. Hạt nano bạc cho thấy hoạt tính kháng nấm A. niger cao (Mousa A. Alghuthaymi và cs 2015).
Các chế phẩm keo nano bạc có kích thước hạt nano là 5, 10 và 15 nm được chế tạo bằng phương pháp chiếu xạ tia gamma (Co-60) sử dụng chitosan 1% làm chất ổn định. Kết quả nghiên cứu hiệu lực kháng nấm, Phytophthora capsici, gây bệnh chết nhanh cho cây hồ tiêu trong điều kiện in vitro của chế phẩm nano bạc – chitosan chế tạo được cho thấy, trong khoảng nồng độ bạc bổ sung từ 20 đến 100 ppm đều có tác dụng ức chế sự phát triển của khuẩn lạc nấm Phytophthora capsici tương ứng từ 22,6% đến 92,9%. Hiệu lực ức chế sự phát triển của nấm gia tăng từ 62,5% lên 100% khi kích thước hạt nano bạc trong chế phẩm chế tạo được giảm từ 15 nm xuống còn 5 nm. Hiệu lực ức chế nấm của chế phẩm có kích thước hạt nano là 5 nm đạt 100% ở tại nồng độ 40 ppm, trong khi đó, chế phẩm có kích thước hạt nano là 10 nm đạt 92,9% ở tại nồng độ 100 ppm. Chế phẩm nano bạc-chitosan chế tạo bằng kỹ thuật bức xạ hứa hẹn sẽ là một sản phẩm công nghệ cao, an toàn và hiệu quả trong phòng và trị bệnh chết nhanh cây hồ tiêu do nấm Phytophthora capsici gây ra (Lê Quang Luân và cs, 2014).
Sử dụng nano Bạc là chất kháng khuẩn, với kích thước của hạt nano bạc từ 40-60 nm có khả năng ức chế được 7 chủng vi khuẩn trong thí nghiệm, trong đó vi khuẩn
Pseudomonas aeruginosa được sàng lọc dễ dàng nhất (Kalimuthu Kalishwaralal, 2010). Nghiên cứu khả năng ức chế của nano đồng + bạc (có kích thước 15-20 nm, với các nồng độ khác nhau 50, 100, 150, 200, 250 ppm) đến sự phát triển của nấm
Pyricularia oryzea gây bệnh đạo ôn lúa trong điều kiện In vitro cho thấy: Đường kính tản nấm Pyriculariaoryzae giảm dần theo chiều tăng nồng độ nano đồng + bạc từ 0 ppm đến 250 ppm. Theo đó, hiệu lực ức chế sinh trưởng của nấm Pyriculariaoryzae
tăng dần theo chiều tăng nồng độ, hiệu lực ức chế sinh trưởng của nấm Pyricularia oryzae cao nhất ở 200 và 250 ppm ở 5 ngày sau nuôi cấy lần lượt là 78,59%, và 100%. Trong điều kiện in vitro, số lượng bào tử nấm Pyriculariaoryzae giảm dần theo chiều tăng nồng độ nano đồng + bạc từ 0 ppm đến 250 ppm. Ở nồng độ 200 và 250 ppm có số lượng bào tử nấm được hình thành thấp nhất đạt 6,3.106 bào tử/ml và 0 bào tử/ml (Nguyễn Thị Thu Thủy và cs, 2017).
Hai tác giả Nguyễn Hồng Sơn (Viện Môi trường nông nghiệp) và Dương Văn Hợp (Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học – ĐHQG Hà Nội) nghiên cứu sử dụng chế phẩm chitosan oligomer có độ pha loãng 300 lần tương đương hàm lượng chitosan oligomer khoảng 120 mg/lít trong phòng trừ một số bệnh hại trên một số cây trồng chính như cà chua, dưa chuột, đậu ăn quả và bắp cải. Hiệu quả trừ các bệnh này khi tưới thuốc vào gốc cao hơn rõ rệt so với chỉ phun trên lá cũng như cao hơn phương pháp phòng trừ mà nông dân đang áp dụng là phun Validacin vào cây sau trồng 5 ngày. Với hiệu quả này, chỉ cần sử dụng chitosan ở nồng độ 1/300 là phù hợp để trừ bệnh chết ẻo cây con; khi trừ bệnh héo xanh vi khuẩn hoặc thối nhũn bắp cải thì phải sử dụng ở nồng độ 1/100. Chitosan có thể hạn chế tốt bệnh hại lá như bệnh sương mai cà chua, phấn trắng dưa chuột, gỉ sắt đậu trạch; hiệu quả trừ bệnh trên lá thấp hơn bệnh hại toàn thân. Hiệu quả trừ bệnh sương mai đạt cao nhất, sau đó đến bệnh phấn trắng và thấp nhất là bệnh gỉ sắt. Khi phun trừ lên lá với tần suất 10 ngày/lần, hiệu quả trừ bệnh đạt cao hơn khi phun 15 ngày/lần (Nguyễn Hồng Sơn và Dương Văn Hợp, 2014). Các hợp chất tự nhiên hiện đang được biết đến như một loại thuốc tiềm năng (tinh dầu, dịch chiết thực vật, các peptide kháng khuẩn, men, .v.v.) đã được nghiên cứu như là sự lựa chọn thay thế đầy hứa hẹn để giảm việc sử dụng hóa chất và thuốc trừ
sâu. Hơn nữa, các phân tử này có thể được đưa vào ma trận phóng thích có kiểm soát trên nền chitosan (như micro và nano) để cải thiện khả năng kháng khuẩn của các ma trận. Do đó sự phát triển của các hạt nano trên nền COS, hoặc một mình hoặc với sự bổ sung của một hợp chất hoạt tính kháng khuẩn, là một lĩnh vực nghiên cứu đầy hứa hẹn còn chưa được khai thác, ví dụ như trong sự kiểm soát nấm và vi khuẩn là hết sức quan trọng đối với cây trồng.
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. PHẠM VI, ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Phạm vi nghiên cứu
- Địa điểm nghiên cứu
Thí nghiệm được tiến hành tại khoa Nông học và xã Tam Xuân II, huyện Núi Thành, tỉnh Quảng Nam.
- Thời gian nghiên cứu
Thí nghiệm được tiến hành trong thời gian từ 1/9/2017 đến 30/4/2018.
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu
- Chủng nấm đạo ôn ĐO 316 được bảo quản tại phòng thí nghiệm Bệnh cây, Bộ môn Bảo vệ thực vật.
- Dung dịch nano đồng - silica với kích thước 15-20 nm, pH=6 được cung cấp bởi Khoa Hóa - Trường Đại học Khoa học Huế.
Nano này đã cho hiệu quả trong ức chế sự sinh trưởng, phát triển của nấm gây bệnh đạo ôn trong điều kiện invitro.
- Giống lúa HT1 đang được trồng phổ biến ở Quảng Nam.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Đánh giá khả năng kháng nấm gây bệnh đạo ôn của các nồng độ nano đồng- silica trong điều kiện invitro.
- Đánh giá khả năng hạn chế bệnh đạo ôn của các nồng độ nano đồng - silica trong điều kiện nhà lưới.
- Đánh giá ảnh hưởng của nano đồng - silica đến sinh trưởng, phát triển, năng suất của cây lúa và khả năng phòng trừ bệnh đạo ôn ở điều kiện đồng ruộng.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp phân lập lại và nhân số lượng nấm đạo ôn
- Phân lập lại các mẫu nấm bảo quản trên môi trường PDA, quan sát sợi nấm dưới kính lúp soi nổi và bào tử nấm dưới kính hiển vi để xác định mẫu nấm được chọn là nấm đạo ôn thuần chủng.
- Nhân số lượng nấm đạo ôn để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo trên môi trường PDA.
2.3.2. Đánh giá sự ảnh hưởng của nồng độ nano đồng - silica khác nhau đến sự sinh trưởng và sự hình thành bào tử của nấm P. oryzae đến sự sinh trưởng và sự hình thành bào tử của nấm P. oryzae
- Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano đồng - silica khác
nhau đến sự sinh trưởng của nấm Pyricularia oryzae:
Môi trường PDA có bổ sung dung dịch nano đồng - silica với các nồng độ 20, 40, 60, 80 và 100 ppm. Các khoanh nấm 7 ngày tuổi có đường kính 6 mm được cấy vào trung tâm đĩa peptri (Ø=9m) chứa môi trường, nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ 280C. Theo dõi đường kính tản nấm P. oryzae sau 3 - 5 ngày nuôi cấy (Elamawi và El- Shafey, 2013). Khả năng kháng nấm của nano được xác định như sau:
HLUC (%) = ((D-d)/D) x 100 Trong đó:
D (mm) là đường kính khuẩn lạc nấm trên môi trường PDA không bổ sung nano (đối chứng);
d là đường kính khuẩn lạc nấm trên môi trường PDA có bổ sung nano ở các nồng độ khác nhau.
- Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano đồng - silica khác
nhau đến sự hình thành bào tử nấm Pyricularia oryzae:
Sau khi tách đơn bào tử, bào tử nấm Pyricularia oryzae được nuôi cấy trên đĩa peptri (Ø=9m) chứa môi trường bột gạo-agar ở điều kiện 250C trong 10 ngày. Cho vào đĩa bào tử nấm 10ml nước cất vô trùng, dùng que thủy tinh gạt lấy hết bào tử trên đĩa, hút dung dịch bào tử vào một ống nghiệm thủy tinh, pha loãng đến nồng độ 106 bào tử/ml. Lấy 500µl dung dịch bào tử nấm cho vào ống eppendof chứa dung dịch nano đồng - silica ở các nồng độ khác nhau tạo thành 1 hỗn hợp có thể tích 1ml. Ủ các ống này trong tủ định ôn ở nhiệt độ 280C trong 24 giờ. Sau đó hút 25μl hỗn hợp cấy lên đĩa peptri (Ø=9m) chứa môi trường PDA và ủ ở 280C, sau 10 ngày cấy bào tử, cho 1 ml nước cất vô trùng vào các đĩa thí nghiệm, dùng que thủy tinh trang đều trên bề mặt đĩa thu được dung dịch bào tử, pha loãng dung dịch bào tử với nước cất vô trùng với tỷ lệ 1:10. Hút 50μl dung dịch bào tử cho vào buồng đếm hồng cầu, kiểm tra số lượng bào
tử dưới kính hiển vi và tính toán số lượng bào tử nấm trong 1ml dung dịch (Elamawi và El-Shafey, 2013).
Phương pháp đếm bào tử trên buồng đếm hồng cầu: theo phương pháp của Ballini và cs, 2013.
2.3.3. Thử nghiệm khả năng hạn chế bệnh đạo ôn của nano đồng -silica trong điều kiện nhà lưới trong điều kiện nhà lưới
- Hạt giống lúa HT1 được gieo trong các chậu nhựa có kích thức 30x30x30cm. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 công thức có nồng độ dung dịch nano đồng - silica khác nhau (0, 20, 40, 60, 80, 100 ppm), mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại gồm 3 chậu. Thời điểm phun nano đồng - silica: 1 ngày trước khi lây nhiễm nấm.
- Đất thịt nhẹ được xử lý với vôi, trộn đều với phân chuồng, phân NPK, sau đó cho vào các chậu nhựa với lượng đất bằng nhau, mỗi chậu gieo 20 hạt giống.
- Lây nhiễm bằng phương pháp phun: cây con ở 4 tuần tuổi (4-5 lá), phun 20ml dung dịch nano ở các nồng độ khác nhau lên cây lúa, để 1 ngày sau đó phun 30ml dng dịch chứa 105 bào tử/ml và 1% gelatin cho 1 chậu lúa. Đặt các chậu nhựa trong nhà lưới, phun giữ ẩm thường xuyên trong khoảng 16-24h, và giữ nhiệt độ khoảng 24- 260C. Cây lúa sẽ được kiểm tra sau 7 ngày lây nhiễm, đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của bệnh dựa vào thang điểm của IRRI, 1996.
+ Bệnh được phân cấp như sau: Cấp 1: < 1% diện tích lá bị hại Cấp 3: 1 đến 5 % diện tích lá bị hại Cấp 5: > 5 đến 25 % diện tích lá bị hại Cấp 7: > 25 đến 50 % diện tích lá bị hại Cấp 9: > 50 % diện tích lá bị hại. Chỉ tiêu đánh giá: Số lá bị bệnh Tỷ lệ bệnh (TLB): TLB (%) = x100 Tổng số lá điều tra Chỉ số bệnh (CSB): CSB (%) = x100 K N 9n 7n 5n 3n n1 3 5 7 9 x
Trong đó:
n1…n9: số lá bị bệnh tương ứng ở mỗi cấp. N: tổng số lá điều tra.
K: là cấp bệnh cao nhất trong phân cấp
2.3.4. Thử nghiệm ảnh hưởng của nano đồng - silica đến sinh trưởng, phát triển, năng suất cây lúa và khả năng hạn chế bệnh đạo ôn ở ngoài đồng ruộng triển, năng suất cây lúa và khả năng hạn chế bệnh đạo ôn ở ngoài đồng ruộng
- Thí nghiệm được bố trí tại vùng trồng lúa thuộc xã Tam Xuân II, huyện Núi Thành, tỉnh Quảng Nam, trên giống lúa HT1. Thí nghiệm gồm 3 công thức, bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên (RCBD) với 3 lần nhắc lại. Diện tích mỗi ô thí nghiệm là 10m2, diện tích toàn bộ thí nghiệm là 150m2.
- Các công thức thí nghiệm:
CT1: Phun nano đồng - silica (nồng độ tốt nhất 100 ppm) CT2: Phun thuốc Filia 525SE (nồng độ theo khuyến cáo) CT3: Phun nước lã (đối chứng)
Công thức Thí nghiệm
CT1 Phun nano đồng - silica
CT2 Phun thuốc Filia 525SE CT3 Phun nước lã (đối chứng)
a, b, c: các lần nhắc lại Sơ đồ bố trí thí nghiệm Bảo vệ B ả o v ệ CT2a CT2b CT1c B ả o v ệ CT3a CT1b CT3c CT1a CT3b CT2c Bảo vệ
- Phun 1 lít nano ở nồng độ 100ppm (nồng độ tốt nhất khi thử nghiệm trong phòng thí nghiệm và nhà lưới) và thuốc hóa học theo liều lượng, nồng độ khuyến cáo. Các ô thí nghiệm được phun nano và thuốc hoá học lần 1 lúc tỷ lệ bệnh đạo ôn trên lá
đạt 5-10%, lần 2 trước khi trổ 1 tuần (Quy phạm TCCS 01-2005 về khảo nghiệm thuốc trừ bệnh đạo ôn hại lúa, Cục bảo vệ thực vật).
2.3.4.1. Đánh giá khả năng kích thích sinh trưởng, phát triển và năng suất cây lúa của nano đồng - silica
+ Xác định chiều cao cây: Chiều cao cây được tính từ mặt đất đến đỉnh lá dài nhất (giai đoạn đẻ nhánh) hoặc đến đỉnh bông vào các giai đoạn chín sữa, vào chắc, chín. + Số nhánh hữu hiệu là những nhánh có mang bông lúa, theo dõi ở giai đoạn trổ bông. + Tỷ lệ nhánh hữu hiệu được xác định theo công thức:
Số nhánh hữu hiệu
% nhánh hữu hiệu = x 100 Tổng số nhánh điều tra
+ Thời gian sinh trưởng: được tính từ ngày gieo đến khi hạt chín (85% số hạt trên các bông đã chín).
+ Xác định các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các công thức thí
nghiệm
Trên mỗi ô thí nghiệm gặt ngẫu nhiên 5 điểm, mỗi điểm có diện tích (40cmx50cm).
. Đếm tổng số bông có trên 5 điểm đó.
. Chọn ngẫu nhiên 10 bông, tách toàn bộ hạt ra khỏi bông, xác định số hạt chắc và hạt lép trên mỗi bông.
. Phơi khô, xác định khối lượng 1000 hạt.
. Năng suất lý thuyết (NSLT) được xác định theo công thức: Số bông/m2 x số hạt chắc/bông x P1000 hạt
NSLT (tạ/ha) =
10 4
Trong đó: P1000 hạt là trong lượng của 1000 hạt, đơn vị gam.
. Năng suất thực tế: Cân khối lượng thực thu sau khi phơi khô, quạt sạch đem cân lấy khối lượng, đơn vị g/m2, quy ra năng suất tạ/ha.
2.3.4.2. Đánh giá hiệu lực hạn chế bệnh đạo ôn trên các công thức thí nghiệm: theo quy phạm TCCS 01- 2005 về phương pháp khảo nghiệm thuốc trừ bệnh