a. Nhuộm Hematoxylin – Eosin (H-E):
* Mục đích: nghiên cứu cấu trúc vi thể của não giữa phôi chuột, phôi người * Các bước tiến hành:
- Cố định Formol: 1- 4giờ; - Rửa bằng nước thường: 30 phút; - Hút nước bằng cồn 70°, 80°, 90°, 95°, 100°;
- Làm trong mô bằng toluene; - Ngấm nến ở tủ 60℃ trong 2 giờ; - Đúc block paraffin;
- Cắt lát 3-4μm;
- Nhuộm tiêu bản bằng Hematoxylin- Eosin, quy trình như sau: (1) Mẫu mô cắt mỏng được đưa lên lam kính;
(2) Dán đều mẫu mô bằng dung dịch Mayer trên mặt phẳng ấm; (3) Để tiêu bản khô trong tủ ấm 45℃ 2 ngày;
(4) Sử dụng 3 lọ toluene để tẩy nến;
(5) Sử dụng 3 lọ cồn 90° (10 phút/1 lọ) để loại bỏ toluene; (6) Rửa bằng nước cất;
(7) Nhuộm Hematoxylin trong 5 phút; (8) Rửa dưới vòi nước lã 30 phút; (9) Nhuộm Eosin trong 5 phút;
(10) Nhúng lam tiêu bản qua 2 cốc cồn 100° trong 10 giây; (11) Tiếp tục ngâm trong toluene nóng 56℃ trong 1 giờ; (12) Dán lamelle phủ mẫu vật lên lam kính;
- Đọc tiêu bản bằng kính hiển vi quang học với độ phóng đại x10, x20 và x40. b. Nhuộm Giemsa:
* Mục đích: Quan sát bề mặt của mẫu tế bào nuôi cấy. * Các bước tiến hành:
(1) Lấy đĩa nuôi cấy ra khỏi tủ ấm và hút bỏ môi trường nuôi cấy; (2) Cố định bằng cồn 100°;
(3) Rửa lại bằng nước thường;
(4) Chuẩn bị Giemsa 10% (Merck – Đức) pha trong nước cất ngay trước khi sử dụng;
(5) Nhuộm Giemsa trong 10 phút;
(6) Rửa đĩa nuôi cấy nhiều lần bằng nước cất; (7) Để khô sau đó kiểm tra trên kính
c. Nhuộm Cajal II:
* Mục đích: Để xác định sự có mặt của xơ thần kinh trong mô não giữa phôi chuột, trong mẫu tế bào nuôi cấy.
* Các bước tiến hành:
(1) Cố định mô trong cồn Amoniac 1 ngày; (2) Rửa nước 30 phút;
(4) Ngâm vào nước cất 1 phút;
(5) Ngâm vào dung dịch Acid pyrogalic 1%, 37℃ trong 1 ngày; (6) Rửa nước cất 5 phút;
(7) Khử nước bằng cồn; (8) Khử cồn bằng toluene; (9) Đúc block;
(10) Cắt tiêu bản;
(11) Tẩy paraffin qua 3 cốc toluene (12) Qua toluene ấm 1 – 2 giờ; (13) Gắn lamelle
Đọc tiêu bản bằng kính hiển vi quang học với độ phóng đại x10 và x40.
2.7.2. Kỹ thuật siêu vi
Mẫu mô não giữa sau phân lập cũng như mẫu tế bào sau nuôi cấy được kiểm tra hình thái siêu vi bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) và kính hiển vi điện tử xuyên (TEM).
*Mục đích: Quan sát cấu trúc siêu vi của mảnh mô não giữa và các tế bào sau nuôi cấy.
* Các bước tiến hành với mẫu TEM
(1) Cố định bằng glutaraldehyte 2,5% pha với đệm PBS qua đêm ở 4℃; (2) Rửa mẫu bằng dung dịch cacodylate 0,1M (15 phút/lần trong 3 lần); (3) Cố định acid osmic 1% trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng;
(4) Rửa mẫu bằng dung dịch cacodylate 0,1M (15 phút/lần trong 3 lần); (5) Khử nước bằng cồn nồng độ tăng dần: 50, 70°, 80°, 90°, 95°, 100° (15 phút/ lần trong 3 lần);
(6) Tẩy cồn bằng propylene oxyte (15 phút/ lần trong 2 lần); (7) Ngâm eponxy nguyên chất qua đêm;
(8) Đúc bằng eponxy nguyên chất trong con nhộng gelatin; (9) Nhuộm bằng Uranyl acetate – 10 phút và citrate chì – 5 phút;
(10) Để mẫu khô tự nhiên;
(11) Quan sát bằng kính hiển vi điện tử xuyên (JEM1010 – JEOL) * Các bước tiến hành với mẫu SEM
(1) Mẫu sẽ được chuyển qua dụng dịch hexamethyldisilazane trong 10 phút, sau đó để khô tự nhiên và phủ vàng
(2) Mẫu được kiểm tra trên kính hiển vi điện tử quét (S-4800 – Hitachi).
2.7.3. Kỹ thuật hóa mô miễn dịch
a. Nhuộm kháng thể Vimentin:
* Mục đích: Quan sát sự hiện diện của xơ Vimentin trong tế bào não giữa phôi cũng như các tế bào sau nuôi cấy
Các bước tiến hành: * Chuẩn bị mẫu: o Với mô não giữa
- Cố định bằng PFA 4% trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng;
- Ngâm sucrose 20% qua đêm ở 4℃ để mô chìm xuống đáy dung dịch; - Đúc block OCT (Tissue Teck, Nhật Bản);
- Đông lạnh ở nhiệt độ -20℃ đến -80℃; - Cắt lát 5 - 10µm bằng máy cắt lạnh; - Để mẫu khô 30 phút ở nhiệt độ phòng; o Với tế bào nuôi cấy
- Cố định tế bào nuôi cấy bằng PFA 4% trong 30 phút ở nhiệt độ phòng * Nhuộm tế bào
(1) Rửa PBS 0,1M 10 phút/lần trong 3 lần;
(2) Hoạt hóa kháng nguyên bằng dung dịch đệm natri citrate 0,1M, pH 6,0 ở 96°C trong 10 phút;
(3) Đưa lại nhiệt độ bình thường, chạy nước 10 phút;
(5) Block kháng nguyên không đặc hiệu bằng dung dịch 5% NGS, 0,1% Triton X-100, PBS 1X trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng;
(6) Nhuộm kháng thể 1: Vimentin (pha loãng 1/300) qua đêm ở 4℃; (7) Rửa PBS 0,1M 1h/lần trong 3 lần;
(8) Nhuộm kháng thể 2: huỳnh quang (Alexa Flour 546, pha loãng 1/200 trong 2h ở nhiệt độ phòng. Từ bước này tránh ánh sáng;
(9) Rửa PBS 0,1M 10 phút/ lần trong 3 lần
(10) Nhuộm nhân bằng Sytox green (pha loãng 1/10.000) trong 1 phút; (11) Rửa bằng PBS 0,1M 10 phút/lần trong 3 lần;
(12) Dán lamelle;
(13) Quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang vật kính x10; x20 và x40. b. Nhuộm kháng thể TH
* Mục đích: Quan sát sự hiện diện của enzym Tyrosine hydroxylase (TH) trong tế bào não giữa phôi cũng như các tế bào sau nuôi cấy.
* Các bước tiến hành:
Tương tự như nhuộm kháng thể Vimentin. Thay bước nhuộm kháng thể 1 bằng cách sử dụng kháng thể TH (pha loãng 1/750) qua đêm ở 4℃.
Các tiêu bản sau khi nhuộm cũng được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.