Nghiên cứu về tính đa dạng họ nấm Ganodermataceae Donk trên thế giới có nhiều tác giả nghiên cứu ở các nước khác nhau như Trung Quốc, Brazil, Mexico, Ấn Độ, Pháp… Cho đến nay có nhiều tác giả nghiên cứu như Alcindo et al (2011) [30], Stéphane & Régis (2010) [55], Bhosle et al (2010) [31], Dong – Mei & Sheng – Hua (2010)[34], Muthelo (2009) [45], Campacci & Gugliotta (2009) [33], Dong – Mei & Sheng – Hua et al (2009)[34], Dine et al (2008) [34], Foroutan et al (2007)[39],Smania et al (2007) [53], Fleischmann et al (2007) [38],Loguercia – Leite et al (2005)[41], Lai et al (2004) [42], Smith et al (2003) [54], Sheng - Hua et al (2003)[55], Ryvarden (1991, 200, 2004)[49,50,51], Ryvarden anh Johansen (1980)[52], Gottlieb et al (1999) [40], Steyaer (1977, 1972, 1962)[56, 57, 58], Teng (1986)[61], Singer (1960, 1986) [59, 60], Pegler et al (1973)[48], Bessey (1950) [34], Patouillard (1897, 1923, 1927, 1928)[46, 47]. Hầu hết các tác giả trên nghiên cứu về tính đa dạng của họ nấm Ganodermataceae Donk ở các vùng khác nhau còn về đặc điểm sinh thái hiện chưa có tác giả nào đề cập đến.
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng
Các loài nấm thuộc họ Ganodermataceae Donk được thu thập tại khu vực Vườn Quốc gia Chư Yang Sin
Các tiêu bản sau khi thu thập ngoài tự nhiên được xử lý khô tiêu bản theo phương pháp của Trịnh Tam Kiệt, Lê Bá Dũng, Ryvarden và lưu trữ lâu dài tại phòng thí nghiệm của Bộ môn Sinh Trường Đại học Tây Nguyên.
Để phục vụ cho việc nghiên cứu của luận văn, đã thu thập trên 200 mẫu, trong đó có 120 mẫu thuộc họ nấm Ganodermataceae Donk.
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu
Vườn Quốc gia Chư Yang Sin
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp điều tra theo điểm
2.2.1.1. Phương pháp điều tra theo điểm
Điểm 1. Rừng lá kim ưu thế Thông 3 lá Pinus kesiya, độ cao 600-1000m;
tọa độ N 12027.705’; E 108022.449’. Địa hình dốc trung bình, nhiều khu vực khá thoải. Cấu trúc rừng gồm 3 tầng: Tầng ưu thế sinh thái là Thông 3 lá, cao khoảng trên dưới 30m, độ che phủ khoảng 0,3, tầng cây gỗ dưới tán gồm một số loài cây thuộc họ Fabaceae, chiều cao cây khoảng 20-25m,tầng cây bụi chủ yếu là dương xỉ và cỏ cao dưới1m, mọc thành từng cụm không liên tục, độ che phủ thấp,vật rơi rụng chủ yếu là lá và quả thông, độ dày thảm mục mỏng, khoảng0,5cm.
Điểm 2. Rừng á nhiệt đới cây lá rộng thường xanh ở độ cao 1000-1500m;
tọa độ N 12025.110’; E 108022.161’ với ưu thế là các loài thuộc họ Dẻ Fagaceae, họ Ngọc lan Magnoliaceae, họ Re Lauraceae... với chiều cao tầng tánưu thế vào khoảng 20-30m và giảm dần khi lên các đai cao hơn.
Điểm 3. Rừng á nhiệt đới hỗn giao cây lá rộng, lá kim ở độ cao 1500- 1900m; tọa độ N12025.300’; E 108024.153’ với các loài ưu thế cây lá kim là Pơ mu
evelyniana; cây lá rộng chủ yếuthuộc về các loài thuộc DẻFagaceae, Ngọc Lan
Magnoliaceae, Re Lauraceae, họ Bứa Clusiaceae...
Điểm 4. Rừng cây lùn trên núi cao ở độ cao 1.900-2.200m; tọa độ N 12025.822’; E 108023.348’, thực vật thân gỗ chủ yếu là các loài thuộc họ Ericaceae, chi Đỗ quyên Rhododendron, các loài thuộc họ DẻFagaceae, Chè Theaceae, Ngọc
lan Magnoliaceae, Hồi Illiaceae...
2.2.1.2. Phương pháp điều tra theo tuyến.
Các tuyến điều tra được thiết kế bằng cách nối các điểm điều tra 1, 2, 3, 4 với nhau và kết hợp với điều tra ngẫu nhiên ở trên lãnh thổ Vườn quốc gia Chư Jang Sin
2.2.2. Phương pháp thu thập mẫu
Thu mẫu và phân tích mẫu nấm được thực hiện theo các phương pháp của Teng (1964) [87], Trịnh Tam Kiệt (1981) [8], Singer R. (1986) [59], Ryvarden (1991) [50].
Nguyên tắc của phương pháp:
+ Thu thập mẫu vật trên các loại hình sinh cảnh khác nhau (rừng lá rộng, rừng lá kim, rừng hỗn giao…)
+ Phân tích các đặc điểm hình thái, cấu trúc hiển vi của các mẫu thu thập được, ngoài ra trong quá trình thu thập mẫu vật ngoài tự nhiên, chúng tôi còn ghi nhận các nhu cầu sinh thái của từng loài. Xác định thời gian mùa vụ, phân bố, ý nghĩa của chúng.
2.2.3. Phương pháp mô tả hình thái và đặc điểm quả thể nấm
Khi thu thập mẫu vật ngoài tự nhiên ghi chép đầy đủ các chi tiết như hình dạng, kích thước, màu sắc mùi vị, các phản ứng với dung dịch hoá học ngay tại nơi thu mẫu (đặc biệt ghi nhận đầy đủ các đặc điểm dễ mất khi bảo quản tiêu bản ở trạng khô). Quan sát bằng mắt thường với sự trợ giúp của kính lúp độ phóng đại 20 lần, lần lượt xem xét và mô tả những đặc điểm về hình thái, màu sắc của nấm theo trình tự như sau:
Cách thức mọc
- Mọc đơn độc hay mọc thành cụm. - Mọc liền gốc hay rời gốc.
- Các đặc điểm đặc biệt khác.
Quả thể:
- Hình dạng quả thể: dạng rốn, dạng phễu, dạng chuông…
- Màu sắc quả thể: Có rất nhiều màu khác nhau như vàng chanh, màu nâu đỏ, xanh nhạt…
- Cấu trúc bề mặt: Khô, nhớt, nhẵn, long, vảy…
Bào tầng:
- Từ gốc đến ngọn hay chỉ một phần nào đó. - Quanh thân nấm hay chỉ ở một phía.
Cuống nấm:
- Có các cấu trúc gai, lông hay không. - Hình dạng - Kích thước - Màu sắc Thịt nấm - Kích thước: Dày, mỏng - Màu sắc - Mùi vị - Độ mềm cứng, dai, giòn
- Phản ứng đổi màu khi tiếp xúc với không khí
2.2.4. Phương pháp mô tả đặc điểm hiển vi của nấm Linh Chi
Phân tích các đặc điểm hiển vi của mẫu vật thuận lợi nhất là dùng mẫu tươi vừa mới thu hái được. Trước hết cắt lấy một quả thể gồm mô nhũ nấm và bào tầng (phiến nấm hay ống nấm). Từ phần quả thể này, phân tích được mối quan hệ giữa mô bất thụ của mũ nấm và mô bất thụ của bào tầng ngoài ra còn phân tích được màu sắc, mùi vị và độ dày thịt nấm. Cũng từ phần quả thể này chúng tôi dùng kim
nhọn tách một phần nhỏ đặt trên lam kính để phân tích cấu trúc của hệ sợi. Dùng dao nhọn cắt vuông gốc với phiến nấm hay ống nấm (cắt song song với chiều thẳng đứng của quả thể) để quan sát và phân tích các hình thái và cấu trúc của các yếu tố trên bào tầng như đảm, đảm bào tử, liệt bào, gai nhọn… trên kính hiển vi với độ phóng đại từ 400 tới 1000 lần. Những mẫu tươi thường được quan sát với nước cất, ở đó ta thu được màu sắc tự nhiên của nấm. Với các mẫu khô thì phải tiến hành quan sát trong dung dịch NaOH 3% để cho các tế bào trương phồng lên trở lại trạng thái ban đầu. Ngoài ra một số mẫu khó quan sát chúng tôi có thể nhuộm bằng dung dịch đỏ Congo, xanh Colton… rồi sau đó dùng giấy lọc thấm khô dung dịch thừa, cho nước cất vào rửa sạch rồi quan sát.
Mặt khác, để quan sát những cấu trúc siêu hiển vi như những trang trí trên bề mặt vỏ bào tử chúng tôi phải tiến hành các phản ứng nhuộm màu bằng Anilin trong Acid lactic, hay dung dịch Melzer để xác định sự tồn tại của tinh bột và làm đậm hơn các cấu trúc hiển vi.
Trình tự của quá trình phân tích cấu trúc hiển vi như sau:
Hệ sợi mũ nấm
- Phân nhánh hay không phân nhánh, có vách ngăn ngang hay không, có khoá hay không có khoá.
- Kích thước đường kính sợi.
- Cấu trúc sợi: Thành sợi dày, mỏng, bắt màu hay không bắt màu.
Bào tử - Hình dạng - Kích thước - Màu sắc - Cấu tạo vỏ - Nội chất Đảm - Hình dạng - Kích thước
- Màu sắc
- Số lượng và cấu trúc cuống bào tử - Cấu tạo thành đảm
Liệt bào và các cấu trúc khác (nếu có)
- Hình dạng - Kích thước - Màu sắc
2.2.5. Phương pháp định loại/định danh theo tên nấm
Phân tích đặc điểm hiển vi và hình thái ngoài ở phòng thí nghiệm bộ môn Sinh học Trường Đại học Tây Nguyên và phòng chụp hình điện tử & siêu cấu trúc ở viện vệ sinh dịch tễ Trung Ương.
Phân tích đặc điểm hiển vi: Bào tử, bào tầng hệ sợi, đảm… sử dụng kính hiển vi Olympus (Nhật), hiển vi điện tử quét S-4800 (Hitachi), kính lúp Olympus (Nhật).
Phân tích đặc điểm hình thái ngoài: Bảng so màu, dung dịch KOH…
Mẫu nấm được thu thập và định danh theo phương pháp hình thái giải phẫu so sánh dựa trên tư liệu của Furtado (1962, 1965) [36,37], Teng (1964) [61], Steyaen (1972, 1980) [56, 58], Ryvarden L (1991, 2000) [50, 51], Trịnh Tam Kiệt (2011, 2012) [9, 11], Campace Thiago Silva et. Al (2009) [33], Bhosle (2010) [31], Pegler Young (2012) [48]
2.3.6. Phương pháp xác định các nhân tố sinh thái
Phương pháp xác định các nhân tố sinh thái (nhiệt độ, độ ẩm, độ cao) sử dụng các thiết bị như Tiger Direct HMAMT-110 (USA), GPS Garmine Trex Vista HCx (USA).
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 Đặc điểm sinh học và phân loại của họ Ganodermataceae Donk
3.1.1 Đặc điểm sinh học họ Ganodermataceae Donk
3.1.1.1. Đặc điểm về cấu trúc bào tử của họ nấm Ganodermataceae Donk
Họ Ganodermataceae Donk có cấu trúc bào tử khá đặc biệt so vợi nấm khác, sự nhận diện hình thái cấu trúc bào tử rất rõ nét, đa số bào tử có hình trứng nhụt một đầu, bầu dục, hay gần tròn gồm 2 lớp, lớp ngoài nhẵn, lớp trong có gai nhỏ (trụ chống) có nhiều hình dạng khác nhau (hình bán nguyệt, hình trụ, ...). Đặc điểm này chỉ có duy nhất ở họ Ganodermataeae Donk và hoàn toàn không có ở các họ nấm khác. Cấu trúc bề mặt ngoài khá đa dạng như hình lưới, hình gai hay nhẵn. Bên cạnh đó bào tử của một số loài xuất hiện cấu trúc mấu lồi njor như kiểu lỗ nảy mầm ở đáy bào tử đối diện với lỗ nấm thường lệch sang 1 phía trái hay phải tùy loài. 3.1.1.2. Đặc điểm khác biệt của cấu trúc bào tử ở các chi trong họ Ganodermataceae Donk
Đặc điểm cấu trúc bào tử của họ Ganodermataceae Donk có đặc trưng riêng là bào tử có dạng hình trứng, hình tròn hay hình bầu dục, gồm hai lớp màng (lớp màng ngoài thường nhẵn, màng trong có gai nhỏ...)
Đối với chi Ganoderma thuộc họ Ganodermataceae Donk có đặc trưng riêng là dạng hình trứng nhụt một đầu (phần lỗ nảy mầm).
Đối với chi Amauroderma thuộc họ Ganodermataceae có đặc trưng là dạng hình trứng hay gần tròn không nhụt đầu.
3.1.1.3. Đặc điểm về quả thể
Hình thái của quả thể (thể sinh bào tử)
Quả thể hay thể sinh bào tử của họ nấm Ganodermataceae Donk rất đa dạng và thường gặp ở các dạng sau:
Dạng mũ đính bên, mũ hình bán cầu dẹp hay dạng hến sò, dạng quạt, ... đính vào giá thể trên một diện rộng. Quả thể nấm trong trường hợp này thường phẳng, dẹp. Quả thể có thể đính đơn độc hay xếp thành dạng ngói lợp, cái nọ trên cái kia. Ngoài ra còn xuất hiện một số hình dạng khác như dạng chùy, dạng san hô phân
nhánh, dạng phiến đơn độc hay phân nhánh. Dạng tán, gồm những mũ nấm đính trên cuống nấm với dạng phụ như có cuống ngắn đến gần như không cuống, cuống đính phía bên trên mũ, cuống lệch và cuống đính giữa.
Mũ nấm cũng gồm rất nhiều dạng khác nhau như: Mũ dạng phẳng, dẹp, lõm dạng rốn
Mũ dạng phễu Mũ dạng bán cầu Mũ dạng chuông Mũ dạng nón
Mặt mũ nấm cũng rất khác nhau tùy vào từng loài. Mũ nhẵn hay có vảy, mụn, u, lồi...; có lông thô hay nhày, dính, màu sắc của mũ nấm hết sức đa dạng và khác nhau, ngoài ra bề mặt mũ nấm tạo nên những đường vân đồng tâm cũng như phóng xạ ở nhiều loại nấm.
Thịt nấm cũng rất khác nhau. Chúng bao gồm chất thịt, chất keo, chất sáp, chất sụn, chất thịt bì, chất bì, chất lie mềm, chất gỗ cứng, chất sừng, ... Chúng có cấu trúc đồng nhất phân tầng gồm 2, 3 lớp có khi có đường đen chạy qua, cấu trúc của thịt nấm và nô của thể sinh sản có thể đồng nhất hay khác nhau. Thịt nấm rất khác nhau về màu sắc, mùi, vị cũng như phản ứng với không khí và các chất hóa học, ví dụ như phản ứng với KOH chuyển sang màu tối hay xanh đen.
Cuống nấm cũng có nhiều kiểu khác nhau: Cuống ngắn hay cuống phôi thai
Cuống đính bên
Cuống nấm rất khác nhau về hình dạng: Hình trụ nếu kích thước ở các phần đều nhau
Phình dạng bụng nếu ở phần giữa cuống phình to hơn Dạng cù nếu phình to ở gốc cuống
Dạng hình thoi nếu thót cả phần trên đỉnh và phần gốc của cuống Dạng rễ nếu gốc của cuống thót dần lại.
Cuống nấm có thể đặc, xốp hay rỗng giữa. Chất thịt của cuống tương tự như mũ hay khác nhau như chất thịt dạng sợi (chất xenluloza), chất thịt, sụn, sừng, gỗ, ... Trên cuống có thể nhẵn hay có các phần phụ như vảy, lông,...
Lớp mặt của mũ
Trong phân loại nấm hiện đại, cấu trúc hiển vi của lớp mặt của mũ trong nhiều trường hợp có ý nghĩa to lớn. Các tế bào cấu trúc nên lớp vỏ của mũ có hình dạng, kích thước, màu sắc, sự sắp xếp rất khác nhau ở các taxon khác nhau. Với các nấm chất gỗ, đáng để ý nhất là cấu trúc lớp vỏ bóng như được đánh vecni hay được sơn. Chúng được tạo thành từ những tế bào phình hình chùy, xen xít nhau thành dạng hàng rào.
Bụi bào tử: ở họ nấm Ganodermateae Donk khi thành thục chúng đều phóng bào tử một cách chủ động vào không khí, màu sắc của bụi bào tử có màu đất đỏ.
Hệ thống sợi nấm
Bao gồm tập hợp các loại sợi cấu trúc nên mô ở các phần khác nhau của quả thể như mô thịt nấm, mô ống hay phiến cũng như cuống nấm. Chúng được tạo thành từ các loại sợi sau:
Sợi nguyên thủy: là sợi nấm khởi đầu, màng mỏng, có chứa nội chất, có vách ngăn điển hình. Chúng có thể có khóa hay không. Chúng có thể khác nhau về độ dày, chiều dài của các tế bào, cấu trúc của nội chất bên trong, bao giờ cũng còn màng ngăn ngang.
Sợi cứng: gồm sợi nấm có màng dày, ít hay hầu như không phân nhánh. Chúng không có vách ngăn và dĩ nhiên không bao giờ hình thành khóa; thường không chứa nội chất ngay từ giai đoạn đầu của quá trình phát triển, vì vậy thường có dạng ống vách dày. Chúng xuất hiện ở phần dính vào giá thể của quả thể nấm và như vậy cùng sự phát triển của quả thể sẽ kéo dài dần ra và hầu như toàn bộ quả thể nấm.
Sợi bện: Sợi nấm mọc trong trường hợp này có màng dày tới màng bình thường, phân nhánh rất nhiều, không có vách ngăn. Chúng xuất hiện từ dạng sợi nguyên thủy, mọc xuyên giữa mô, bện kết các sợi khác lại.
Dựa vào sự có mặt của các sợi trên mô, người ta chia ra các hệ thống sợi nấm sau:
Hệ sợi đơn độc chỉ gồm những sợi nấm nguyên thủy.
Hệ sợi hai loại (dimitric) gồm những sợi nấm nguyên thủy và sợi cứng hay gồm sợi nguyên thủy và sợi bện, cũng dòn được gọi là hệ sợi hai loại với sợi bện.
Hệ sợi ba loại (trimitric) gồm cả 3 loại sợi nguyên thủy, sợi cứng và sợi bện. Ngoài ba loại sợi trên, trong mô còn có thể gặp sợi nấm dạng lông cứng khổng lồ, liệt bào dạng cầu. Hơn thế nữa giữa 3 dạng chính trên còn có những dạng chuyển tiếp, vì vậy ranh giới giưa chúng không bao giờ rõ rệt. Trong phân loại hiện đại, việc phân tích sợi ngày càng có ý nghĩa quan trọng, đặc biệt khi xem xét quan hệ họ hàng giữa các nhóm nấm.
3.1.2. Phân loại họ Ganodermataceae Donk
Thành phần loài của họ nấm này cũng khá đa dạng. Quả thể dày, có mũ và cuống, cuống nấm thường đính lệch bên hay không cuống, mũ nấm bóng láng thường có màu sáng như màu đỏ, vecni, nâu, nâu đỏ, xám ...
Thịt nấm chất gỗ hay chất bì dai, màu nâu, nâu vàng hay nâu tối.
Bào tầng dạng hình ống hình tròn hay hình đa giác, phân thành lớp rõ ràng so với thịt nấm.
Bào tử có hai lớp màng: màng ngoài nhẵn, màng trong có gai nhỏ ( đặc điểm này chỉ có ở họ Ganodermataceaae không có ở bất kỳ loài nấm lớn nào) thường có màu rỉ sắt.
Hầu hết nấm thuộc họ Ganodermataceae mọc thành cụm, liền hay rời gốc trên gỗ, hay trên tàn dư thực vật ở dưới tán rừng, một số ít mọc nhiều năm (nấm đa niên).
3.1.2.1. Khóa định loại tới chi của họ Ganodermataceae
Quả thể chất gỗ đến chất bě dai, sống hoại sinh tręn gỗ, ít khi kí sinh. Quả thể có mũ và cuống hay không cuống, cuống nấm thường nằm lệch một bên, màu nâu