CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.8. Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật
Hoạt tính kháng vi sinh vật đƣợc tiến hành để đánh giá hoạt tính của các mẫu dung dịch nano bạc Pu-AgNPs tạo thành, đƣợc thực hiện trên phiến vi lƣợng 96 giếng theo phƣơng pháp hiện đại của Vander Bergher và Vlietlinck (1991) và McKane & Kandel (1996). Khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của sản phẩm đƣợc kiểm tra thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là IC50 (nồng độ ức chế 50%) và MIC (nồng độ diệt khuẩn tối thiểu).
Thử nghiệm với các chủng vi khuẩn Gr(-): Escherichia coli (ATCC
8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), vi khuẩn Gr(+): Bacillus subtillis (ATCC 6633), Staphylococcus aureus (ATCC 6538), nấm sợi (mốc): Aspergillus niger (ATCC 9763), Fusarium oxysporum (ATCC 48112), nấm
men: Saccharomyces cerevisiae (ATCC 16404), Candida albicans (ATCC
10231).
Chứng chuẩn (nguồn ATCC, Manassas, Mỹ) đƣợc cung cấp bởi Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng và lƣu giữ tại phòng Sinh học thực nghiệm (Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên).
Mơi trƣờng: Saboraud 4% Dextrose Agar (SDA; Merck, Damstaadt, CHLB Đức) cho nấm men và nấm mốc. Tryptic Soy Agar (TSB-Merck) cho vi khuẩn.
Kháng sinh chuẩn:
- Gentamycin cho vi khuẩn Gr(-), Doxycyclin cho vi khuẩn Gr(+) và Nystatin cho nấm sợi và nấm men. Kháng sinh đƣợc cung cấp bởi Viện kiểm nghiệm Tp.HCM.
- Từ dung dịch mẹ, pha dung dịch gốc bằng nƣớc cất vô trùng. Từ dung dịch gốc pha lỗng ½ đến nồng độ cần dùng: Gentamycon (16 – 8 - 4 IU/mg), Doxycyclin (0,4 – 0,2 – 0,1 IU/mg) và Nystatin ( 12 – 6 – 3 IU/mg).
Cách tiến hành:
- Pha loãng mẫu thử trong DMSO 10% trên phiến 96 giếng (template plate) theo nồng độ giảm dần (log2 cho 5 thang nồng độ). Nhỏ mẫu từ phiến template lên phiến 96 giếng (phiến test) và bổ sung dịch vi sinh vật để đƣợc dải nồng độ mẫu từ 200-100-50-25,5-12,5 µg/ml (lặp lại 3 lần ở mỗi nồng độ) với mẫu thơ và 50-25-12,5-6,25 µg/ml với mẫu chất tinh sạch. Để trong tủ ấm ở 37o
C trong 24 giờ đối với vi khuẩn và 30oC/48h đối với nấm.
- Mẫu đối chứng: sử dụng NaCl 0,9% tƣơng ứng với thể tích mẫu là mẫu chứng âm tính (-) và chứng dƣơng tính (+) là các kháng sinh chuẩn.
vật ở ít nhất một nồng độ mẫu thử nghiệm so với chứng (-) (khi nuôi cấy lại ở nồng độ này kiểm tra trên đĩa thạch giá trị CFU < 5). Mẫu biểu hiện hoạt tính đƣợc test ở dãy nồng độ mẫu khác nhau để xác định đƣợc nồng độ ức chế tối thiểu MIC (µg/ml) là nồng độ thử nghiệm thấp nhất mà vi sinh vật bị ức chế.
- Mẫu đƣợc xác định có hoạt tính khi giá trị MIC ≤ 200µg/ml đối với mẫu thơ và ≤ 50µg/ml đối với mẫu tinh sạch.