do cơ chế chuyển gen ngang (HGT-horizontal gene transfer). Vi nấm nội sinh sản sinh ra một số hợp chất để duy trì mối quan hệ cộng sinh với cây chủ, thúc đẩy sự phát triển của cây chủ và giúp chúng tồn tại được trong cây chủ [47]. Chuyển gen ngang thường được quan sát trong sinh vật nhân sơ và cho đến gần đây được chứng minh cĩ tầm quan trọng hạn chế đối với sinh vật nhân chuẩn. Hezari và cộng sự đã tách dịng thành cơng gen ts và chỉ ra rằng gen này cĩ nguồn gốc thực vật chứ khơng phải cĩ nguồn gốc từ vi nấm [48]. Kết quả giải trình tự gen khác như dbat và bapt cho thấy trình tự nucleotide của các gen từ nấm cĩ độ tương đồng cao gen tương ứng từ cây thơng đỏ. Khơng riêng vi nấm sinh paclitaxel, nhiều chất kháng tế bào ung thư khác gồm podophyllotoxin, camptothecine, vinblastine, hypericin và diosgenin đã được tìm thấy ở vi nấm ký sinh trên cây chủ cĩ khả năng sinh chất tương đương [47, 49].
So với phương pháp truyền thống tốn nhiều thời gian và cơng sức, việc sử dụng chỉ thị phân tử đang là cơng cụ hữu hiệu nhằm sàng lọc các chủng vi nấm cĩ khả năng sinh paclitaxel. Dựa trên sự bảo thủ của 3 gen chính tham gia sinh tổng hợp paclitaxel, các cặp mồi PCR đặc hiệu được thiết kế dựa trên các vùng bảo thủ của gen ts, dbat và bapt. Gen ts được khuếch đại thành cơng từ các chủng nấm khác nhau như Fusarium solani, Taxomyces andreanae và
Gibberella intermedia. Sản phẩm PCR khuếch đại gen dbat được quan sát thấy ở nấm Fusarium solani, Cladosporium cladosporoides, Aspergillus candidus và Fusarium redolens. Ngồi ra, gen bapt được khuếch đại thành cơng ở Colletotrichum gloeosporioides, Guignardia mangiferae và Fusarium redolens. Hiện nay, cĩ hơn 30 chủng vi nấm nội sinh sinh tổng hợp paclitaxel dao động từ 10 ng/L đến 800 μg/L thơng qua sàng lọc truyền thống/chỉ thị phân tử.
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠI VIỆT NAM VỀ VI NẤM NỘI SINH SINH
Ở Việt Nam, gần đây đã cĩ đề tài nghiên cứu về vi nấm nội sinh; tuy nhiên, các nghiên cứu chuyên sâu về nấm nội sinh cây thơng đỏ bắc (T. chinensis) đến nay chưa cĩ nhiều cơng bố. Năm 2010, nhĩm nghiên cứu của PGS. TS. Lê Mai Hương tại Viện Hĩa học các hợp chất thiên nhiên, Viện
Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam đã tách chiết thành cơng chất 10- deacetil baceatin III (10-DAB), tiền chất của paclitaxel, từ cây thơng đỏ Nam thu thập tại Việt Nam. Từ mẫu cây, nhĩm nghiên cứu đã phân lập được 6 chủng vi nấm. Năm 2010, nhĩm nghiên cứu này cho rằng, vi nấm nội sinh được phân bố trên các bộ phận ở mức độ khác nhau, nhiều nhất ở lá (50 chủng), thân (43 chủng), cành (39 chủng), rễ (24 chủng) và ít nhất là ở quả (1 chủng). Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học cho thấy, 17 chủng (chiếm 25%) thể hiện hoạt tính gây độc 3 dịng tế bào ung thư. Bằng phương pháp phân loại hình thái và sinh học phân tử đã định tên được 4 chủng vi nấm tiềm năng gồm Trichoderma aureoviride SHT06; Daldinia fissa SHT46; Eupenicillium ehrlichii SHT101 và Gongroniella butleri SHT106. Cơng trình nghiên cứu này bước đầu đã minh chứng tiềm năng khai thác các chất cĩ hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn nội sinh trên cây thơng đỏ.
Năm 2014, Đàm Sao Mai và cộng sự đã nghiên cứu lựa chọn mơi trường nuơi cấy thích hợp cho chủng vi nấm nội sinh Fusarium oxyporum
trên cây thơng đỏ (T. wallichiana) tại Lạc Dương, Lâm Đồng. Khả năng sinh paclitaxel của chủng nấm đạt cao nhất 250,98 mg/kg sinh khối khơ [50]. Các kết quả này là tiền đề và cơ sở khoa học để các nhà khoa học trong nước thực hiện các nghiên cứu tiếp theo tạo nguồn nguyên liệu paclitaxel chữa bệnh ung thư ở quy mơ cơng nghiệp.
Tại Việt Nam, hiện vẫn chưa cĩ nghiên cứu sâu về các hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào ung thư từ các chủng vi nấm nội sinh trên cây thơng đỏ
T. chinensis tại Hà Giang. Nghiên cứu này rất cần thiết vì khơng những khai thác nguồn vi nấm bản địa cĩ khả năng sinh các chất kháng sinh và kháng tế bào ung thư mới mới mà cịn gĩp phần bảo tồn lồi thơng đỏ quý hiếm đang bị đe dọa tuyệt chủng ở Việt Nam.
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG
2.1.1. Chủng giống
Bộ sưu tập vi nấm nội sinh gồm 25 chủng được phân lập từ các mẫu cây thơng đỏ (Taxus chinensis) thu thập tại huyện Quản Bạ và huyện Đồng Văn tỉnh Hà Giang năm 2019, được lưu giữ tại Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
Các chủng vi sinh vật kiểm định: Escherichia coli ATCC 11105,
Bacillus cereus ATCC 11778, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027,
Candida albicans ATCC 10231, Staphylococcus epidermidis kháng methicilin (MRSE) ATCC 35984 và Staphylococcus aureus kháng methicilin (MRSA) ATCC 33591, Enterococcus faecalis ATCC 29212 nhận từ Bộ sưu tập giống VSV của Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
Các dịng tế bào ung thư gồm A-549 (ung thư phổi người), MCF-7 (ung thư vú người) do J. M. Pezzuto, Trường Đại học Long-Island, US và GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp.
2.1.2. Hĩa chất, thiết bị
Một số hĩa chất chính cho thí nghiệm : Cao nấm men, cao thịt, trypton (Himedia-Ấn Độ); glucose (Trung Quốc); NaCl (Trung Quốc), KH2PO4, K2HPO4, MgSO4 (Trung Quốc); trypsin (Merck, Đức); DPPH (Merck, Đức); dimethyl sulfoxide (DMSO) (Merck, Đức); ethyl acetate (Sigma, Mỹ); SRB (Sulforhodamine B) (Gibco, Mỹ); agar (Viết Nam)và một số hĩa chất phân tích khác.
Các thiết bị, dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu này được trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Một số thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên thiết bị, dụng cụ Xuất xứ
1 Máy cơ quay chân khơng IKK của Đức 2 Máy ảnh kỹ thuật số Canon IXY Digital 70 Nhật Bản
3 Cân kỹ thuật Precisa XB 1200C Thụy Sĩ
4 Cân phân tích Shimazu AY120 Nhật Bản
5 Máy ly tâm lạnh Biofuge Fresco, Kendro, Đức
6 Máy lắc cĩ kiểm sốt nhiệt độ BSI-25R CPT, Mỹ
7 Nồi khử trùng ALP MC-40DP, Nhật Bản
8 Tủ ấm Trung Quốc
9 Lị vi sĩng Sharp, Nhật Bản
2.1.3. Mơi trường
PDA (g/L): Khoai tây 200; glucose 20; MgSO4 0,2; K2HPO4 0,2; agar 20; pH 6,5
PDB (g/L) : Khoai tây 200; glucose 20; MgSO4 0,2; K2HPO4 0,2; pH 6,5
LB (g/L): NaCl 10; tryptone 5; Cao nấm men 5; agar 20; pH 7
Hansen (g/L): Glucose 20; peptone 10; KH2PO4; MgSO4 2; agar 20; pH 6
Czapek-Dox (g/L) : Sucrose 30,0; NaNO3 2,0; K2HPO4 1,0; MgSO4.7H2O 0,5; KCl 0,5; FeSO4.6H2O 0,01; agar 15; pH 7,3.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng vi nấm nội sinh được xác định bằng phương pháp đục lỗ thạch kết hợp hiệu chỉnh theo El-Sayed và cộng sự (2019) [51]. Các chủng vi nấm được nuơi cấy trên mơi trường PDB ở nhiệt độ 30⁰C trên máy lắc tốc độ 200 vịng/phút trong 7 ngày. Mơi trường thạch LB sau khi khử trùng xong để nguội đến nhiệt độ 30-
37⁰C, hút dịch VSV kiểm định cĩ mật độ tế bào đạt 5 x 108 CFU/mL lên trên bề mặt đĩa Petri hoặc các khay. Khi thạch đơng dùng dụng cụ đục lỗ thạch vơ trùng đục lỗ và lấy các thỏi thạch ra. Sau 7 ngày nuơi cấy, thu hồi và ly tâm dịch nuơi cấy các chủng vi nấm với tốc độ 6.000-8.000 vịng/phút ở 4⁰C. Bổ sung 100 μL dịch vào các giếng thạch trên đĩa Petri và đặt các đĩa trong tủ lạnh khoảng 5-6 giờ để dịch từ các giếng khuếch tán ra mơi trường nuơi cấy vi sinh vật. Sau đĩ, đặt các đĩa vào tủ ấm 28-30⁰C trong 14-18 giờ, quan sát vịng kháng khuẩn.
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được xác định theo kích thước vịng kháng khuẩn (VKK) theo cơng thức:
VKK = D - d (mm),
Trong đĩ: D: Đường kính vịng kháng khuẩn (mm) d: Đường kính lỗ thạch (mm)
2.2.2. Tách chiết các hoạt chất sinh học thơ từ vi nấm nội sinh
Phương pháp tách chiết các hoạt chất sinh học từ vi nấm nội sinh được tiến hành theo mơ tả trước đây [52]. Các chủng nấm được cấy vào mơi trường PDB (100 mL) và ủ ở 25⁰C trên máy lắc trong 5 ngày và được sử dụng làm bình giống gốc. Tiếp giống 3% v/v (15 mL) được chuyển vào 500 mL PDB và ủ ở 25°C trong 21 ngày trong bĩng tối như một mơi trường nuơi cấy tĩnh. Sau đĩ, dịch nuơi được lọc qua bốn lớp vải thưa để loại bỏ các sợi nấm. Các sợi nấm sau khi thu hồi được làm khơ qua đêm ở 35 – 40°C và chiết xuất bằng ethyl acetate trong 12 giờ. Mơi trường nuơi cấy cũng được chiết với ethyl acetate theo tỉ lệ 1 : 3. Phần dung mơi phía trên được thu lại và cơ quay ở 60oC. Sau đĩ cặn kháng sinh thơ được làm khơ và cân đến khối lượng khơng đổi (cao chiết). Quá trình tách chiết được lặp lại 2 – 3 lần. Cao chiết được bảo quản ở 4oC cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.3. Xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư
Phương pháp gây độc tế bào đươc xác định tại phịng Thử nghiệm sinh học, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất cĩ khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương đã được cơng bố trước đây [53]. Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đĩ lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:
- Trypsin hĩa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.
- Chất thử đã pha ở nồng độ 100 µg/mL được đưa vào các giếng của đĩa 96 giếng. Giếng khơng cĩ chất thử nhưng cĩ tế bào ung thư (190 L) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0 tế bào sẽ được cố định bằng Trichloracetic acid – TCA 20%.
- Ủ trong tủ ấm 72 giờ. Sau 72 giờ, tế bào được cố định bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37 oC, rửa 3 lần bằng acetic acid rồi để khơ ở nhiệt độ phịng.
- 10 mM unbuffered Tris base để hịa tan lượng SRB, lắc nhẹ trong 10 phút rồi đọc kết quả OD ở bước sĩng 540 nm trên máy ELISA Plate Reader (Biotek).
- Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào khi cĩ mặt chất thử sẽ được xác định thơng qua cơng thức sau:
- Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine ở các nồng độ 10 g/mL; 2 g/mL; 0,4 g/mL; 0,08 g/mL được sử dụng như là chất đối chứng tham khảo;
- DMSO 1% luơn được sử dụng như đối chứng âm (nồng độ cuối cùng trong giếng thử là 0.05%). Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4.
- Theo tiêu chuẩn của Viện ung thư quốc gia Hoa Kỳ (NCI), cặn chiết được coi cĩ hoạt tính tốt với IC50 20 μg/ml, trong khi chất tinh khiết được coi cĩ hoạt tính tốt khi IC50 5 μM [54].
2.2.4. Khảo sát khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của các chủng tuyển chọn chọn
Khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của cao chiết được được tiến hành theo mơ tả trước đây [55]. Hỗn hợp phản ứng gồm 40 µL DPPH (1000 µg/mL) và 960 µL cao chiết cĩ nồng độ khác nhau 25, 50, 100, 200, 400 µg/mL. Hỗn hợp được ủ trong tối ở nhiệt độ 30ºC trong thời gian 30 phút, đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sĩng 517 nm. Chất chuẩn được sử dụng là ascorbic acid. Phần trăm loại bỏ gốc tự do được tính theo cơng thức:
% Loại bỏ gốc tự do = x 100%
Trong đĩ: AC là giá trị hấp thu của đối chứng, AS hấp thu của mẫu.
2.2.5. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp paclitaxel thơng qua sàng các gen chỉ thị chỉ thị
Các chủng vi nấm nội sinh được nuơi cấy trên PDA lỏng trong 3 – 5 ngày, sau đĩ li tâm thu sinh khối ở 10.000 vịng trong 5 phút. DNA tổng số được tách chiết bằng kit Dneasy Plant Mini kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sàng lọc vi nấm nội sinh sản xuất paclitaxel bằng PCR dựa trên 3 cặp mồi (Bảng 2.2) cho dbat (dbat-F/dbat-R);
bapt (bapt-F/bapt-R); ts (ts-F/ts-R) theo chu trình nhiệt được trình bày trong Bảng 2.3 [56, 57]. Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0%.
Bảng 2.2. Trình tự cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại các gen dbat, bapt và ts
Gen Tên đoạn
mồi Trình tự mồi (5′ - 3′) Kích thước dự đốn TLTK dbat dbat-F GGGAGGGTGCTCTGTTTG 153 – 650 bp [57] dbat-R GGCCTGCTCCTAGTCCATCACAT bapt bapt-F CCTCTCTCCGCCATTGACAA 450 - 600 bp [57] bapt-R GTCGCTGTCAGCCATGGCTT ts ts-F ATCAGTCCGTCTGCATACGACA 400 – 500 bp [56] ts-R TAAGCCTGGCTTCCCGTGTTGT
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại các gen
dbat, bapt và ts
Gen Các bước Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ TLTK
dbat Biến tính 95 6 phút 1 [56] Biến tính 94 50s 35 Gắn mồi 50 30s Kéo dài 68 50s Kết thúc 68 10 phút 1 bapt Biến tính 95 6 phút 1 [56] Biến tính 94 50s 30 Gắn mồi 55 50s Kéo dài 68 50s Kết thúc 68 10 phút 1 ts Biến tính 6 phút 1 [57] Biến tính 94 50s 32 Gắn mồi 55 1 phút Kéo dài 72 80s Kết thúc 72 7 phút 1
2.2.6. Xác định đặc điểm hình thái và bào tử của các chủng vi nấm nội sinh tuyển chọn sinh tuyển chọn
Xác định đặc điểm hình thái : Các chủng vi nấm tuyển chọn được nuơi cấy trên mơi trường Czapek-Dox trong 3-10 ngày ở 28⁰C và được quan sát đặc điểm hình thái theo các khĩa phân loại nấm [58, 59] , dựa trên một số đặc điểm chính sau:
- Hình dạng khuẩn lạc: trịn, vơ định hình - Bề mặt: lồi lõm, nhung mượt, mịn, xốp, ...
- Màu sắc khuẩn lạc, sự thay đổi màu khuẩn ty khí sinh theo thời gian nuơi cấy
- Dạng mép khuẩn lạc: mỏng, dày, phẳng, răng cưa, ...
- Giọt tiết trên bề mặt khuẩn lạc: ít hoặc nhiều, màu sắc giọt tiết - Tiết màu sắc vào mơi trường nuơi cấy
Xác định đặc điểm bào tử : Các chủng nấm sợi được nuơi cấy trong tủ ấm ở 28-30°C trên mơi trường thạch Czapek-Dox cĩ cắm la men nghiêng. Sau 72 giờ, lamen được lấy ra quan sát hình thái cuống sinh bào tử và bào tử được quan sát dưới kính hiển vi quang học tập trung vào một số điểm:
- Sợi nấm (hyphae): cĩ vách ngăn, khơng cĩ vách ngăn, cĩ mấu, ... - Bào tử (conidia): kiểu phát sinh bào tử, hình dạng, kích thước, cách sắp xếp, ...
- Cuống sinh bào tử: cĩ vách ngăn hoặc khơng, cĩ hoặc khơng cĩ cấu trúc đặc biệt như tế bào chân, cĩ hoặc khơng cĩ hình thái đặc biệt như bĩ giá, đệm giá.
Căn cứ vào kết quả quan sát về đặc điểm khuẩn lạc, đặc điểm vi thể, các chủng nấm nghiên cứu được xác định tên khoa học theo các khĩa phân loại.
2.2.7. Phân loại các chủng vi nấm nội sinh được tuyển chọn bằng giải và phân tích trình tự vùng ITS phân tích trình tự vùng ITS
Các chủng vi nấm nội sinh được nuơi cấy trên PDA lỏng trong 3 – 5 ngày, sau đĩ li tâm thu sinh khối ở 10.000 vịng trong 5 phút. DNA tổng số
được tách chiết bằng kit Dneasy Plant Mini kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. DNA tổng số được sử dụng như là