CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN ĐỀ TÀI
1.2 TỔNG QUAN VỀ SÂM NGỌC LINH
1.2.9 Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy
1.2.9.1 Môi trường nuôi cấy
Mức độ thành công của các kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật liên quan đến một số nhân tố. Một trong những nhân tố quan trọng nhất là thành phần dinh dƣỡng môi trƣờng nuôi cấy. Trong 20 - 30 năm qua, có nhiều báo
cáo bổ sung lẫn nhau cho thấy có khoảng 24 môi trƣờng đƣợc sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Thành phần môi trƣờng nuôi cấy mô thực vật thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy hay sự phát triển phân hóa của mô cấy. Tùy theo mục đích duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, muốn tạo rễ, tạo mầm hay muốn tái sinh cây hoàn chỉnh, môi trƣờng nuôi cấy sẽ có sự thay đổi khác biệt nhiều hay ít. Tuy nhiên, thành phần môi trƣờng nuôi cấy sẽ bao gồm các nhóm cơ bản nhƣ sau:
- Các muối khoáng đa lƣợng - Các muối khoáng vi lƣợng - Đƣờng làm nguồn carbon - Các vitamin
- Các chất điều hòa sinh trƣởng
- Các chất bổ trợ nhƣ: chất hữu cơ có thành phần hóa học xác định (amino acid, EDTA…) hoặc không xác định (nƣớc dừa, cao nấm mem…).
1.2.9.2 Các muối khoáng đa lượng
Nhu cầu muối khoáng của mô tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Các nguyên tố đa lƣợng cần phải cung cấp là: nitrogen, phospho, potasium, calcium, magnesium, ferric.
Nguồn nitrogen
Mô tế bào thực vật trong nuôi cấy có thể sử dụng nitrogen khoáng nhƣ amonium và nitrat, đồng thời có thể sử dụng các dạng nitrogen hữu cơ nhƣ amino acid. Tỷ lệ nitrogen dạng amonium và nitrat thích hợp tùy theo loài cây và trạng thái phát triển của mô.
Nitrat đƣợc cung cấp dƣới dạng muối nutrat Ca(NO3)2.4H2O, KNO3, NaNO3 hoặc NH4NO3. Trong một số ít trƣờng hợp có thể cung cấp dƣới dạng urea. Tổng nồng độ của NO3- và NH4+ trong môi trƣờng thay đổi từ 3 - 6 mM, thông thƣờng khoảng 20 mM.
Nguồn phospho
Hai dạng muối phospho thƣờng dùng nhất là NaH3PO4.7H2O và KH2PO4. Nồng độ phospho trong môi trƣờng biến thiên từ 0,15 - 4 mM,
thƣờng dùng khoảng 1 mM.
Nguồn potasium
Ngƣời ta cung cấp kali cho mô nuôi cấy dƣới dạng KNO3, KCl, KH2PO4. Nồng độ K+ trong môi trƣờng biến thiên từ 22 - 25 mM trung bình khoảng 10 mM.
Nguồn calcium
Calcium đƣợc cung cấp dƣới dạng muối Ca(NO3)2.4H2O, CaCl2.6H2O hoặc CaCl2.2H2O. Nồng độ Ca2+ trong môi trƣờng nuôi cấy từ 1 - 3,5 mM, trung bình là 2 mM.
Nguồn magnesium
Magne đƣợc cung cấp dƣới dạng MgSO4.7H2O với nồng độ trong môi trƣờng từ 0,5 - 3 mM.
Nguồn ferric
Những môi trƣờng cổ điển dùng sắt dƣới dạng: FeCl2, FeCl3.6H2O, FeSO4.7H2O, Fe2(SO4)3, Fe(C4H4O6). Hiện nay, hầu hết các phòng thí nghiệm đều dùng sắt ở dạng chelat kết hợp với Na2-Ethylen diamin tetraacetat (Na2- EDTA). Ở dạng này sắt không bị kết tủa và giải phóng dần ra môi trƣờng theo nhu cầu của mô thực vật.
1.2.9.3 Các muối khoáng vi lượng
Nhu cầu muối khoáng vi lƣợng của mẫu thực vật trong nuôi cấy là lĩnh vực còn ít đƣợc nghiên cứu. Rất ít các nguyên tố vi lƣợng đã đƣợc chứng minh là không thể thiếu đối với sự phát triển của mô và tế bào thực vật. Vấn đề này đã đƣợc sinh lý thực vật giải quyết đối với các cây hoàn chỉnh. Vì vậy, để an toàn, các tác giả đã cung cấp hầu hết các nguyên tố vi lƣợng cần thiết đối với mẫu cấy cho nuôi cấy trong môi trƣờng nhân tạo.
Bảng 1.3:Một số vi lƣợng thông dụng Tên vi lƣợng Đang sử dụng Nồng độ µm Tên vi lƣợng Đang sử dụng Nồng độ µm Mangan (Mn) MnSO4.4H2O 15 - 100 Bo (B) H3Bo3 6 - 100 Kẽm (Zn) ZnSO4.7H2O 15 - 30 Đồng (Cu) CuSO4.5H2O 0,04 - 0,08
Coban (Co) CoCl2.6H2O 0,1 - 0,4
Iode (I) KI 2,5 - 20 Molypden (Mo) (NH4)6Mo7O24.4H2O NaMoO4.2H2O 0,007 - 1 1.2.9.4 Nguồn carbon
Trong nuôi cấy nhân tạo, nguồn carbon giúp mô tế bào thực vật tổng hợp nên chất hữu cơ để tế bào phân chia, tăng sinh khối. Nguồn carbon có đƣợc không phải do quá trình quang hợp cung cấp mà do nguồn đƣờng trong môi trƣờng. Hai dạng đƣờng thƣờng sử dụng nhất là: sucrose và glucose nhƣng hiện nay sucrose đƣợc dùng phổ biến hơn. Tùy theo mục đích nuôi cấy, nồng độ sucrose trong môi trƣờng biến đổi từ 1 - 6% thông dụng nhất là 2% tƣơng ứng với 58,5 mM (1 mM = 1 mmol/l).
Một số tác giả đã thành công trong việc nuôi cấy các tế bào đơn chứa diệp lục có khả năng quang hợp. Nhờ vậy, nồng độ đƣờng trong môi trƣờng có thể giảm xuống rất thấp hoặc loại bỏ hẳn. Nuôi cấy các tế bào thực vật tự dƣỡng là một hƣớng quan trọng trong nuôi cấy tế bào đơn.
1.2.9.5 Các vitamin
Các vitamin thƣờng đƣợc pha hỗn hợp trong dung dịch mẹ có nồng độ cao gấp 500 hoặc 1000 lần dung dịch làm việc. Các dung dịch vitamin dễ
hỏng do nấm khuẩn nhiễm tạp, vì vậy cần giữ trong điều kiện lạnh. Nên chia sẵn dung dịch mẹ ra nhiều lọ nhỏ, mỗi lọ đủ dùng cho vài lít môi trƣờng và bảo quản trong ngăn đá tủ lạnh.
Bảng 1.4: Các vitamin thƣờng dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
Tên Vitamin Nồng Độ (ppm)
Myo-Inositol 100
Nicotinic acid (Vitamin B5 hay PP) 0,5 - 1
Pyridoxin hydroclorid (Vitamin B6) 0,005 - 0,5
Thiamin hydroclorid (Vitamin B1) 10 - 50
Panthothenate calci (Vitamin B3) 1 - 5
Ribiflavin (Vitamin B2) 1 - 5
Biotin (Vitamin H hay B8) 0,1 - 1
Acid folic (Vitamin B9) 0,1 - 1