(DNA barcoding)
Tách chiết DNA tổng số từ các mẫu vây cá và nhân gen đích bằng kỹ thuật PCR
DNA tổng số đƣợc tách chiết từ vây của mỗi cá thể cá bằng cách sử dụng protein K với bộ kit Wizard SV genomic DNA purification (Promega, Madison, WI, USA) theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
Gen đích thuộc vùng gen COI của DNA ti thể (mtDNA) sẽ đƣợc nhân lên thông qua phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR). Các cặp mồi thƣờng dùng cho các loại cá đã đƣợc công bố bởi các tác giả Ward và cs. (2005) với cặp mồi: 5′ TCA ACC AACC AC AAA GAC AT TGG C AC-3′ và 5′ -TAGAC T TC TGG GTGG CC AA AGAATC A-3′.
Điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số và sản phẩm PCR
DNA tổng số và sản phẩm PCR (5µl DNA + 2 µl H2O + 2 µl loading dye 6X + 1 µl SYBR Gold 10X) lần lƣợt đƣợc kiểm tra trên bản điện di agarose 0,8% và 2% với dòng điện 80V trong vòng 45 phút và trong đệm 0,5X TAE. Sau đó bản gel điện di đƣợc quan sát và chụp ảnh trên bàn soi gel
DigiGenius với tia UV (Syngene-Anh).
Giải trình tự nucleotide của các gen đích nghiên cứu
Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng bộ kít “Wizard SV Gel and PCR clean-up System” của Promega (Mỹ) theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất và sử dụng làm khuôn trực tiếp cho phản ứng tiền giải trình tự theo nguyên tắc dye- labelled dideoxy terminator (Big Dye® Terminator v.3.1. Applied Biosystems) với các đoạn mồi tƣơng tự nhƣ phản ứng PCR. Sản phẩm đƣợc phân tích trên máy phân tích trình tự tự động ABI Prism® 3100 DNA Analyser (USA). Các trình tự đƣợc kết nối bằng kỹ thuật Contig Express trong phần mềm package vector NTI v.11.
Xử lý các trình tự nucleotide của gen đích
Các trình tự đƣợc chỉnh sửa bằng phần mềm Sequencher 4.0.4 (Gene Codes Corporation, 2002) và dóng hàng bằng phần mềm Clustal X v.1.8 (Kochzius và cs., 2008) và MEGA X. Các trình tự tiếp tục đƣợc so sánh xác định mức độ tƣơng đồng với các trình tự trên Genbank thông qua công cụ BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Các trình tự sau đó đƣợc tính hệ số K2P để xác định các cá thể cá cùng loaì nghiên cứu bằng phần mềm MEGA X (Ward và cs., 2009)
Xây dựng cây phát sinh loài đƣợc tiến hành dựa trên thuật toán Neightbour joining (NJ) bằng phần mềm Mega X với hệ số Bootstrap lặp lại 1000 lần (Kumar và cs., 2004).
Phân tích các đặc điểm mã vạch DNA của các loài cá nghiên cứu Đặc điểm đa dạng: Các trình tự nucleotide của gen đích sẽ đƣợc tính toán các hệ số đa dạng di truyền đang đƣợc sử dụng phổ biến trong đánh giá sự đa dạng di truyền (genetic diversity) của quần thể và giữa các quần thể cá: tổng số haplotype (h), đa dạng haplotype - haplotype diversity (Hd), đa dạng nucleotide - nucleotide diversity (Pi), số sai khác trung bình (k), số lƣợng của vị trí đa hình - polymorphic sites (s) bằng cách sử dụng phần mềm DNAsp v5.0 (Librado và Rozas, 2009).
- Cấu trúc di truyền quần thể: Phần mềm Arlequin 3.5.1.2 (Excoffier và Lischer, 2010) đƣợc sử dụng để phân tích, kiểm tra cấu trúc di truyền quần thể của từng loài cá nghiên cứu giữa các khu vực thu mẫu (FST; FSTs).
- Đặc điểm kết nối giữa các haplotype: Mạng lƣớihaplotype và kết nối di truyền giữa các quần thể nghiên cứu đƣợc thực hiện bởi phần mềm